问题4：有阳性条带，但条带比较弱
（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶活性降低
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中靶蛋白含量太低
增加标本上样量。
（4）洗膜过度
缩短洗涤时间。
（5）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
（6）抗体活性降低
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。
（7）封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。
（8）曝光时间过短
延长曝光时间。
（9）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
问题5：条带位置（大小）不对；或有非特异性条带
（1）二抗的非特异性结合
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。
（2）一抗的特异性不够
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。
（3）蛋白降解
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。
（4）二聚体或多聚体存在
增加蛋白质变性过程及强度。
（5）抗体浓度过高
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。
（6）蛋白上样量过大
降低上样量。
问题6：背景有斑点
（1）封闭剂中有聚集体
使用前过滤封闭试剂。
（2）HRP耦联二抗中有聚集体
过滤二抗试剂，去除聚集体。
问题7：膜上出现反像（暗背景上白色带）
（1）HRP含量过高
降低酶联二抗的浓度。
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