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免疫组化技术专题:MTT(四唑盐比色实验)大汇总(二)

2020.6.16
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

二、实验步骤

(一)贴壁细胞

1.  收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100 ul,铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。

2.  5%CO2,37 ℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100 ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。

3.  5%CO2,37 ℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

4.  每孔加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5% MTT),继续培养4 h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

5.  终止培养,小心吸去孔内培养液。

6.  每孔加入150 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

7.  同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

(二)悬浮细胞

1.  收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40 ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10 ul用培养液稀释 (储存液100 ug/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10 ul;④细胞悬液50 ul(即5×104cell/孔),共100 ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100 ul 1640)。

2.  置37 ℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

3.  每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570 nm(630 nm校准)测量各孔的吸光值)

4.  离心(1000转x10 min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm(630 nm校准)测量各孔的吸光值。

5.  同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。


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