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酵母质粒提取离心法操作步骤

2020.6.23
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

酵母质粒提取离心法操作步骤:

1.接种5 mL含有酵母携带所需质粒的YDP培养液,将其振荡培养在30℃16-24小时。

2.取1-3ml酵母培养菌体(使用< 2×107细胞),室温下5000× g离心5 min。

3.弃培养液,收集菌体,加入480μL Buffer SE30μL Lyticase solution。以最快的速度涡旋悬浮1min。充分悬浮细胞颗粒有助于提高得率。将其置于30℃消化30min左右。

注:在使用前确保β-mercaptoethanol已添加到Buffer SE (10µL /毫升)中,这种混合液可以在室温很好的放置时间为1周。

4.将混合液颗粒在4,000 x g室温离心5min,弃上清完全。

5.加入250 µL Buffer YPI重新悬浮混合液颗粒。

6.加入50 mg 玻璃珠,然后以最快速度涡旋5min,让样品在玻璃珠作用下沉降稳定下来。转移上清至一个1.5ml离心管中。

7.加入250 µL Buffer YPII,反复颠倒混匀离心管4-6次以获得干净的溶解产物。将其室温放置5 min。

注:此步应避免高强度混合,因为这将使染色体DNA断裂以及降低质粒纯度。YPII在存储时要盖紧盖子。

8.加入350µL Buffer YP III,用手大幅度颠倒混匀样品直到形成絮凝白色沉淀。室温下13,000 × g离心10min。

9.将干净的上清液小心转移至DNA Mini Column,取上清时尽量不要打扰颗粒与沉淀。室温下10,000 × g离心30s。倒掉废液,将吸附柱重新插入收集管中。

10.向吸附柱中加入500 μL Buffer KB,12,000 rpm转离心30秒,弃收集管与废液。

11.将吸附柱放入一个新的收集管中,加入650 μL Wash Bufffer(确保已加入乙醇),12,000离心30秒,倒掉废液,将吸附柱重新插入收集管中。

注:Wash Buffer 用无水乙醇稀释后使用。

12.可选步骤:重复步骤11。

13.13,000 rpm 开盖离心2分钟。

注:开盖离心有助于去除残留乙醇,乙醇的有效去除保证DNA的洗脱。

14.将柱子放入一个新的1.5ml离心管中,向柱中加入50-100 µL Elution Buffer(10 mM Tris-HCL, pH 8.5),室温放置1 min,13,000 x g离心1 min进行洗脱。

可选步骤:第一次洗脱通常能得到75-80% DNA,用50-100 µL预热(65°C) Elution Buffer再次洗脱DNA,第2次洗脱可收获另外20%的DNA


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