电针对阿尔茨海默病模型大鼠行为学的影响

【摘要】 目的 通过针刺的方法治疗阿尔茨海默病模型大鼠,观察对其学习和记忆的改善效果。方法 通过给大鼠灌服 D-半乳糖制剂,造成大鼠阿尔茨海默病模型。分别设立正常组、模型组、药物组、针刺组、电针组。正常组、模型组只给予相同剂量的生理盐水灌服,药物组给予石杉碱甲片(哈伯因)混悬液灌服治疗,针刺组采用针刺百会、神庭、肾俞、太溪、足三里的方法进行治疗,电针组采用针刺百会、神庭、肾俞、太溪、足三里穴,并连接电针仪进行治疗。以 10 d 为 1 个疗程,共治疗3 个疗程。通过大鼠跳台试验来检测大鼠的学习和记忆能力,并对大鼠大脑海马 CA1 区的 tau 蛋白含量进行观察。 结果 造模后,正常组大鼠的记忆逃避潜伏期时间明显少于模型组(P＜0.05),治疗结束后药物组、针刺组、电针组的逃避潜伏时间短于模型组(P＜0.05)。电针组的疗效优于针刺组和药物组(P＜0.05)。而治疗后,海马 CA1 区的 P-tau 蛋白表达治疗组都低于模型组,且电针组的效果要优于药物组和针刺组(P＜0.05)。结论 运用电针能改善阿尔茨海默病模型大鼠的记忆能力,对阿尔茨海默病有一定的治疗作用。

【关键词】 针刺;阿尔茨海默病;记忆能力;大鼠

随着年龄的增大,老年人中痴呆的发生率逐渐增高,其中以阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)最为多见。这是一种中枢神经系统(大脑)神经细胞的脱髓鞘式退变。临床上主要表现为记忆能力、判断能力、学习能力以及行动能力、生活自理能力普遍下降,给患者生活质量和家庭生活都带来了不利的影响。目前尚未有特效药物和治疗方法问世,中医的针灸治疗在临床上却收到了较为明显的改善效果。其中的作用机制却未被揭示,本文从神经行为学和组织化学的层面作了观察,期望为针刺治疗该病的机制提供佐证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要器材

采用由上海欣软信息科技有限公司生产的Morris 水迷宫,为改良型水迷宫,其跳台可以定时出现。由日本株式会社生产的 B50 型天平,由美国 Sigma生物技术有限公司提供的测试AD P-tau蛋白的原位杂交试剂盒。中国江苏华佗医疗设备厂出产的“长城牌”电针仪。

1.1.2 主要应用试剂

诱发 AD 模型所用 D-半乳糖由北京贝瑞和康生物技术有限公司生产,药物组所用药物为河南竹林众生制药有限公司生产的石杉碱甲片(哈伯因)混悬液。

1.2 动物筛选

将所有购自黑龙江中医药大学动物实验中心的Wistar 大鼠放入水迷宫中,进行适应性的游泳训练,记录其游泳距离,学习逃避潜伏期和学习错误次数,训练 1 星期。然后将游泳能力障碍、学习记忆能力先天不足的大鼠予以淘汰,最后选取符合实验条件的 50 只大鼠进入最后实验程序。

1.3 模型制备方法

将准备造模的大鼠放入相同环境中进行适应性喂养 1 星期,保持充足的光线、水分和食物。然后按每只大鼠每千克体重 200 mg 的剂量向脐腹部注射 D-半乳糖,每日注射 1 次。一共持续 6 星期时间。然后将所有造模大鼠编号,按随机原则分为模型组 10 只、药物组10 只、针刺组 10 只、电针组 10 只。取正常大鼠 10只作为正常组。

1.4 治疗方法

治疗开始后,正常组、模型组均给予每日捆绑30 min,并灌服与药物组灌服药物相同量的生理盐水;药物组则每日灌服石杉碱甲片混悬液 2 mL(17 mg);针刺组则用华佗牌0.30×13 mm针灸针针刺大鼠百会、神庭、肾俞、太溪、后三里穴,得气后行针 2 min,留针 30 min;电针组则在针刺组的基础上接“长城牌”电针仪,采用疏密波,时间 30 min。百会穴在头顶正中线中点头骨中央;神庭穴在头顶正中线前端;肾俞穴在后正中线上,于第二腰椎棘突下旁开 1 寸;太溪穴在后肢踝部外侧后方凹陷处;后三里在大鼠后肢膝部外侧前下方。 所有大鼠治疗时间为 6 星期,每日治疗 1 次。

1.5 测试和取材观察方法

跳台试验。Morris 水迷宫的游泳池中有一块橡胶平台,离水面有 1 cm。将大鼠放入水池中开始记时,当大鼠通过游泳寻找到水下的平台时记为学习逃避潜伏期。24 h 后再重复以上试验,第 2 次所需时间为记忆逃避潜伏期。以此作为大鼠的学习和记忆能力的反应指标。分别在造模前第 1 星期、治疗前第 7 星期、治疗后第13星期3个时间点进行大鼠学习逃避潜伏期和记忆逃避潜伏期的测试。

水迷宫试验结束后,将大鼠进行麻醉,接着通过脑过量灌注致其死亡。将大鼠头骨切开取出大鼠脑组织,放入深度为 4%的 1/1000 DEPC 溶液中保存,再使用多聚甲醛予以固定待检。将固定的脑组织由额极向枕极顺序平均分成 5 份,取出第 2 份脑组织放入 24℃的水中用乙醇进行梯度脱水处理。其顺序是 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇 1 度、100%乙醇 2 度、100%乙醇 3 度,然后染色切片并用二甲苯使组织透明。用AD P-tau 蛋白原位杂交试剂盒进行 tau 蛋白过度磷酸化阳性检测。细胞中出现的棕黄色颗粒者即为过度磷酸化 tau 蛋白表达。最后对 tau 蛋白阳性表达数进行统计。

1.6 统计学方法

用电子计算机编辑图像和表格。

所有数据用SPSS13.0 软件包进行统计。计量资料的表示方式为均数±标准差,用方差来分析组与组之间的均数对比,以P ＜0.05 为衡量标准。在对阳性细胞数的观察时每个载玻片取 3 个视野,计取其平均颗粒数。

2.1 大鼠的一般情况

正常组的大鼠体力充沛,反应灵敏,动作迅捷,毛色光泽,饮食、排便情况正常。 造模组大鼠均出现不同程度的神疲乏力,反应迟笨,行动萎钝,体力差,毛色粗糙,饮食量差,排便少或便质稀溏。这种情况自造模后开始呈现,直至实验结束。

2.2 大鼠行为学指标观察结果

从表 1 可以看出,造模前各组大鼠的学习逃避潜伏时间大致相等,差异无统计学意义(P ＞0.05);治疗前(即造模 6 个月后),各造模组大鼠学习逃避潜伏时间明显延长,与正常组相比差异有统计学意义(P ＜0.05),提示造模成功,大鼠学习能力有所下降,具备AD 初步特征。治疗后,即第 13 星期,各治疗组大鼠的学习逃避潜伏时间又比模型组明显缩短,差异有统计学意义(P ＜0.05),说明经过针刺或药物治疗,AD 大鼠学习能力有了一定的恢复。而电针组的情况更为乐观,与其他治疗组相比,学习逃避潜伏时间缩短更为明显,差异有统计学意义(P ＜0.05)。从表 2 可以看出,造模前各组大鼠的记忆逃避潜伏时间大致相等,差异无统计学意义(P ＞0.05);治疗前(即造模 6 个月后),各造模组大鼠记忆逃避潜伏时间明显延长,与正常组相比差异有统计学意义(P ＜0.05),提示造模成功,大鼠记忆能力有所下降,具备AD 初步特征。治疗后,即第 13 星期,各治疗组大鼠的记忆逃避潜伏时间又比模型组明显缩短,差异有统计学意义(P ＜0.05),说明经过针刺或药物治疗,AD 大鼠记忆能力有了一定的恢复。而电针组的情况更为乐观,与其他治疗组相比,记忆逃避潜伏时间缩短更为明显,差异有统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

许多研究都充分地证实,人对空间结构的学习能力和记忆能力更多地建立在大脑组织中的海马神经元,而 AD 则是对该区的脑组织造成持续性的神经细胞的退行性改变而使空间学习和记忆能力下。学习和记忆能力作为痴呆患者智力指标的重要考查要点,具有金指标的指示地位,所以在实验中我们把大鼠的学习、记忆逃避潜伏期作为观察指标。以上的结果清楚地表明,经过腹腔灌服 D-半乳糖后,AD 模型大鼠的空间学习和记忆能力已经是明显退化了,说明 D-半乳糖的吸收可以造成大鼠大脑细胞退行性改变,tau蛋白等负面物质的产生,使大脑功能退化。然而通过针刺后,大鼠在水迷宫的表现令人欣慰,虽然在治疗的 6星期期间,大鼠的脑细胞仍然处于退变状态,但潜伏时间并没有下降得很快,甚至电针组还有所提升,实验证实,针刺治疗能够与西药一样起到改善脑部功能的作用。经过治疗,大鼠的学习和记忆能力都较治疗前有回升。当然,由于 AD 不仅是功能变化,也有一部分器质上的改变,所以针刺只能在一定范围内起到治疗恢复的作用,而不能使 AD 大鼠的记忆功能完全恢复,但是实验也显示,电针相对于普通针刺更有效,说明如果对针刺手法和方式进行改进,能够进一步扩大疗效,使治疗后效果无限接近于正常。从生物化学层面分析,tau 蛋白过量产生,对脑功能是一种负面影响,药物组和针刺组都不同程度地达到抑制该蛋白产生的目的。而电针能更有效地降低 tau 蛋白的表达率,一方面说明了 tau的确对大鼠记忆系统造成紊乱,另一方面也提示如果能降低 tau 蛋白的表达,那么就能一定程度地改善大脑功能。