GABA能神经元和谷氨酸能神经元在电针镇痛效应中新机制

　　研究背景：

　　电针镇痛效应目前已经在世界范围内得到了广泛认可，但其在中枢神经系统的确切靶点和细胞特异性的镇痛机制仍然没有得到充分的认识。［1-3］。已有研究证实，电针可以诱导c-fos在中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray, PAG）中特异性表达［4］，腹外侧中脑导水管周围灰质(ventrolateral periaqueductal gray, vlPAG)是介导疼痛调节的神经通路的重要组成部分［5］。

　　内源性镇痛物质阿片肽和大麻素通过间接抑制局部GABA能中间神经元的抑制效应来激活下行通路，因此使输出神经元对脊髓的痛觉信息传递产生去抑制作用［6］。内源性大麻素系统是中枢神经系统中控制疼痛传导和针刺镇痛的重要神经调节系统，其介导的抗伤害作用在下行抑制性镇痛通路的激活中起到重要作用［7-8］。

　　vlPAG中的GABA能神经元和谷氨酸能神经元在伤害性信息处理中起着重要而又复杂的作用。在vlPAG中微量注射谷氨酸激动剂或GABA拮抗剂可以产生显著的抗伤害性刺激效应［9,10］。大麻素受体1(Cannabinoid receptor 1, CB1)在PAG中GABA能神经元和谷氨酸能神经元的神经末梢均有表达，CB1受体的激活可能调节GABA能和谷氨酸能神经元的传递［11-12］。之前的研究结果表明，CB1受体参与电针镇痛［13］。那么vlPAG中GABA能神经元和谷氨酸能神经元是否参与CB1受体介导的电针镇痛呢？

　　2019年5月17日，华中科技大学同济医学院神经生物学系李熳团队在《Frontiers in Neuroscience》上在线发表了题为“Inhibition of GABAergic Neurons and Excitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor”的文章。该研究发现了电针通过CB1受体激活vIPAG中GABA能神经元和抑制谷氨酸能神经元而发挥镇痛作用，vIPAG中GABA能神经元上的CB1受体是电针镇痛的重要靶点。该研究为电针能够通过CB1受体双向调控vIPAG中的GABA能神经元和谷氨酸能神经元而产生镇痛效应的机制提供了新的实验证据。

　　电针能有效降低CCI和KOA小鼠的疼痛敏感性

　　首先，团队对小鼠采用与大鼠坐骨神经慢性损伤（CCI）［14］类似的方法，使其产生神经病变来制备CCI模型；采用左膝关节内注射碘酸单钠（MIA）来诱导膝骨关节炎（KOA）模型。通过电针治疗CCI和KOA小鼠，发现电针显著增加其机械痛阈值和热痛阈值（图1A-D）。并且在条件性位置偏爱实验中，小鼠在与电针治疗进行条件性配对后，逗留在明箱的时间显著增加（图1E-H）。

　　图1.电针能有效降低CCI和KOA小鼠的疼痛敏感性

　　抑制vlPAG中GABA能神经元产生镇痛效应

　　课题组为了验证抑制vlPAG中的GABA能神经元是否可以发挥镇痛作用，应用了化学遗传学策略，将rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gi)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG的右侧，目的是特异性的抑制GABA能神经元的活动 (图 2A)。这种病毒混合物同样注射到GAD67-GFP小鼠的右侧vlPAG区，用来验证病毒的转染效率(图2B, C)。vlPAG中约有80.5%标记上的神经元和GAD67-GFP阳性神经元共定位(图 2D)。

　　图2.病毒混合物标记率

　　随后，化学遗传抑制CCI和KOA小鼠GABA能神经元，能有效地模拟电针的效应，包括镇痛效应(图3A–H).

　　图3.VlPAG中GABA能神经元的化学遗传抑制能模拟EA的效应

　　激活vlPAG中GABA能神经元只能部分减弱电针的镇痛效应

　　接下来，为了验证激活GABA能神经元是否能翻转电针的镇痛的效应。团队将rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG中以达到激活GABA能神经元的目的。

　　意外地发现，激活vlPAG中GABA能神经元后只能部分降低电针治疗组小鼠的机械痛阈值和热痛阈值(图 4A-D)，同时也只能部分降低条件性位置偏爱实验中小鼠待在明箱的时间（图4E-H）。

　　图4.vlPAG中GABA能神经元的化学激活仅部分减弱了EA的效应

　　激活vlPAG中GABA能神经元和抑制谷氨酸能神经元可以有效拮抗电针的镇痛效应

　　单独激活GABA能神经元只能部分的减弱电针的镇痛效应，为了验证GABA能神经元和谷氨酸能神经元都参与了电针的镇痛效应。研究团队在vlPAG中GABA能神经元被激活的基础上，另外使用rAAV-CaMKIIa-HA-KORD-IRES-mCitrine-WPRE-pA病毒来选择性抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元的活动。发现激活vlPAG中的GABA能神经元并抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元可以大幅降低小鼠的机械缩腿阈值和热痛阈值(图5A-D)，以及在条件性位置偏爱实验中明箱逗留的时间(图 5E-H)。

　　图5.vlPAG中的GABA能神经元的化学激活与VlPAG中谷氨酸能神经元的化学抑制相结合能有效地减弱电针的效应

　　GABA能神经元上的CB1受体参与了电针对疼痛超敏反应的作用

　　接下来，为了验证vlPAG中GABA能和谷氨酸能神经元的轴突上表达的CB1受体是否参与电针的镇痛作用。研究人员在赛业生物构建的mCnr1flox/flox小鼠右侧vlPAG中注射了rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒，特异性敲除vlPAG中GABA能神经元上的CB1受体；在mCnr1flox/flox小鼠右侧vlPAG中注射rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA病毒，特异性敲除vlPAG中谷氨酸能神经元上的CB1受体(图6A, C)。

　　图6.特异性敲除位于vlPAG内的GABA能神经元上的CB1受体

　　实验发现，特异性敲除GABA能神经元上的CB1受体可以消除电针的镇痛效应，显著降低了机械痛阈值和热痛阈值(图 7A-D)以及在条件性位置偏爱实验中明箱的逗留时间（图7E-H）。特异性敲除vlPAG中谷氨酸能神经元上的CB1受体仅轻微地减弱电针的镇痛效应。结果表明，vlPAG中位于GABA能神经元上的CB1受体才是电针发挥镇痛效应的基础。

　　图7.特异性敲除GABA能神经元CB1受体消除电针对疼痛反应敏感的效应

　　总而言之，该研究证明了vlPAG中GABA能神经元和谷氨酸能神经元在电针镇痛效应中的新机制，即电针可以通过CB1受体同时抑制vlPAG中GABA能神经元和激活vlPAG中谷氨酸能神经元来发挥镇痛效应。特异性敲除GABA能神经元上的CB1受体能够完全消除电针的镇痛效应，而只有激活vlPAG中的GABA能神经元联合抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元才能够完全翻转电针的镇痛作用。电针能够通过CB1受体在GABA能系统和谷氨酸能系统上同时发挥不同的调节功能。这项研究可能为临床疼痛治疗和镇痛药物的发展提供了一个新的思路。

　　作者简介：

　　李熳，1973年出生，博士、教授、硕士研究生导师、博士研究生导师。湖北省神经科学学会副秘书长、武汉市针灸学会常务理事。evidence-based complementary and alternative medicine 杂志编委。

　　1995年6月毕业于湖北中医学院，获得针灸专业医学学士学位；1998年6月毕业于湖北中医学院，获得针灸专业医学硕士学位；2001年6月在原同济医科大学神经生物学系获得中西医结合基础专业医学博士学位，作为主要参加人员完成导师为关新民教授的国家自然科学基金课题 (no.39970889)，对电针治疗炎性痛时“气至病所” 的外周机制进行了一系列的研究，掌握了经络实质和针刺镇痛原理研究的前沿知识，并积累了丰富的技术经验；2001年7月在华中科技大学同济医学院神经生物学系留校任讲师； 2003年7月在华中科技大学同济医学院神经生物学系任副教授； 2006年3月－2007年9月在澳大利亚新南威尔士大学解剖学系进修一年半，研究外周补体参与神经病理痛的机制，掌握了各种炎性痛、神经病理痛模型的制备方法和研究思路，为进行针刺镇痛原理研究奠定了坚实的基础；2007年9月回国，在华中科技大学同济医学院神经生物学系任副教授；2009年11月至今在华中科技大学同济医学院神经生物学系任教授。主持或参与国家自然科学基金等省市级以上科研项目12 项， 指导研究生获得湖北省优秀硕士学位论文奖3项。在国内外重要学术刊物上发表论文 30 余篇。获得实用新型ZL一项。

　　研究方向：疼痛的细胞与分子神经生物学，针刺对疼痛调整的机制研究

　　原文检索：

　　Inhibition of GABAergic Neurons anExcitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor .

　　doi: 10.3389/fnins.2019.00484

　　参考文献：

　　Liu, L., Zhao, L. P., Zhang, C. S., Zeng, L., Wang, K., Zhao, J., et al. (2018). Acupuncture as prophylaxis for chronic migraine: a protocol for a singleblinded, double-dummy randomised controlled trial. BMJ Open 8:e020653. doi: 10.1136/bmjopen-2017-020653

　　Mist, S. D., and Jones, K. D. (2018). Randomized controlled trial of acupuncture for women with fibromyalgia: group acupuncture with traditional chinese medicine diagnosis-based point selection. Pain Med. 19, 1862–1871. doi: 10.1093/pm/pnx322

　　Musil, F., Pokladnikova, J., Pavelek, Z., Wang, B., Guan, X., and Valis, M. (2018). Acupuncture in migraine prophylaxis in Czech patients: an openlabel randomized controlled trial. Neuropsychiatr. Dis. Treat. 14, 1221–1228. doi: 10.2147/NDT.S155119

　　Fusumada, K., Yokoyama, T., Miki, T., Wang, Z. Y., Yang, W., Lee, N. S., et al. (2007). c-Fos expression in the periaqueductal gray is induced by electroacupuncture in the rat, with possible reference to GABAergic neurons. Okajimas Folia Anat. Jpn. 84, 1–9. doi: 10.2535/ofaj.84.1

　　Ho, Y. C., Lee, H. J., Tung, L. W., Liao, Y. Y., Fu, S. Y., Teng, S. F., et al. (2011). Activation of orexin 1 receptors in the periaqueductal gray of male rats leads to antinociception via retrograde endocannabinoid (2-Arachidonoylglycerol)-induced disinhibition. J. Neurosci. 31, 14600–14610. doi: 10.1523/JNEUROSCI. 2671-11.2011

　　Meng, I. D., Manning, B. H., Martin, W. J., and Fields, H. L. (1998). An analgesia circuit activated by cannabinoids. Nature 395, 381–383. doi: 10.1038/26481

　　Chen, L., Zhang, J., Li, F., Qiu, Y., Wang, L., Li, Y. H., et al. (2009). Endogenous anandamide and cannabinoid receptor-2 contribute to electroacupuncture analgesia in rats. J. Pain 10, 732–739. doi: 10.1016/j.jpain.2008.12.012

　　Palazzo, E., Luongo, L., Novellis, V., Rossi, F., and Maione, S. (2010). The role of cannabinoid receptors in the descending modulation of pain. Pharmaceuticals 3, 2661–2673. doi: 10.3390/ph3082661

　　Bobeck, E. N., Chen, Q., Morgan, M. M., and Ingram, S. L. (2014). Contribution of adenylyl cyclase modulation of pre -and postsynaptic GABA neurotransmission to morphine antinociception and tolerance. Neuropsychopharmacology 39, 2142–2152. doi: 10.1038/npp.2014.62

　　Takasu, K., Ogawa, K., Nakamura, A., Kanbara, T., Ono, H., Tomii, T., et al. (2015). Enhanced GABAergic synaptic transmission at VLPAG neurons and potent modulation by oxycodone in a bone cancer pain model. Br. J. Pharmacol. 172, 2148–2164. doi: 10.1111/bph.13039

　　Drew, G. M., Mitchell, V. A., and Vaughan, C. W. (2008). Glutamate spillover modulates GABAergic synaptic transmission in the rat midbrain periaqueductal grey via metabotropic glutamate receptors and endocannabinoid signaling. J. Neurosci. 28, 808–815. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4876-07.2008

　　Tjen-A-Looi, S. C., Li, P., and Longhurst, J. C. (2009). Processing cardiovascular information in the vlPAG during electroacupuncture in rats: roles of endocannabinoids and GABA. J. App. Physiol. 106, 1793–1799. doi: 10.1152/japplphysiol.00142.2009

　　Yuan, X. C., Zhu, B., Jing, X. H., Xiong, L. Z., Wu, C. H., Gao, F., et al. (2018). Electroacupuncture potentiates cannabinoid receptor-mediated descending inhibitory control in a mouse model of knee osteoarthritis. Front. Mol. Neurosci. 11:112. doi: 10.3389/fnmol.2018.00112

　　Bennett, G. J., and Xie, Y. K. (1988). A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain 33, 87–107. doi: 10.1016/0304-3959(88)90209-6

　　本文由李熳教授撰稿，赛业生物授权编辑。

　　索取资料

　　来源：赛业（广州）生物科技有限公司

　　联系电话：400-680-8038

　　E-mail：info@cyagen.com