（一）技术原理
1．标记原理
活体荧光成像技术主要有三种标记方法。
（1）荧光蛋白标记：荧光蛋白适用于标记细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；
（2）荧光染料标记：荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等；
（3）量子点标记：量子点（quantum dot)是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，是由数百到数万个原子组成的原子簇，尺寸在100nm以下，外观恰似一极小的点状物。量子点作为一类新型的荧光标记材料，其在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。与传统的有机荧光试剂相比较，量子点荧光比有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。主要应用在活细胞实时动态荧光观察与成像，可以在长达数天内进行细胞的分化和世系观察, 以及细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪。不但如此，量子点还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用。
2．光学原理
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在小动物体内比蓝绿光的穿透性要好得多，随着发光信号在体内深度的增加，波长越接近900nm的光线穿透能力越强，同时可消减背景噪音的干扰，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。在实验条件允许的条件下，应尽量选择发射波长较长的荧光蛋白或染料。
（二）活体动物荧光成像技术应用领域
1．肿瘤学
活体荧光成像技术能够无创伤定量检测小鼠的皮下瘤模型。相对于生物发光成像技术，活体荧光成像技术检测时间较快，只需要不到1s的时间，同时不需要注射底物，节约了检测成本。但是需要选择近红外荧光检测深部组织，目前此波段的荧光蛋白种类有限，精确定量较难。
（1）GFP标记的肺肿瘤模型（H-460-GFP）
H-460-GFP是一个绿色荧光蛋白表达细胞系，它起源于H-460肺小细胞肺癌，稳定转染了绿色荧光蛋白基因，并由SV-40启动子起始基因的表达。
通过H-460-GFP皮下肿瘤模型，建立小鼠肺癌的实验模型，可用来进行有关抗癌药物的筛选（图11-3）。可用于测量皮下肿瘤的生长和监测对潜在化学治疗药物的反应。
图11-3 左图是接种后1w荧光成像，右图是3w荧光成像（上海市肿瘤研究所供图）
（2）量子点标记细胞系
通过量子点可以标记肿瘤细胞，用量子点Qtracker® 705对MDA-MB-231乳腺癌细胞进行标记，皮下接种后动态观察其生长以及变化（图11-4）。激发光波长625nm ，散射光波长680nm。
图11-4 量子点标记肿瘤细胞不同时间荧光成像
2．抗体
分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构（如肽类、酶的底物、配体等），另一端则是荧光染料。通过Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验，可见肝、肾等处的分布（图11-5）。
图11-5 Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验（上海市肿瘤研究所供图）
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