六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）
1、收获细胞
肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时
2、阻断Fc受体
用于消除非特异性的结合染色
① 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断
3、细胞表面染色
① 加适当的细胞表面染色试剂
② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）
③离心500g 5分钟，弃上清
4、固定和破膜
① 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；
② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）
3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。~③ 加2
5、细胞内染色
① 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。
LPBS上机或加入500 L 1% PFA固定后再上机m② 加2、3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500
七、注意事项
1、标本处理
避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2、刺激激活
检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析
3、选择合适的对照
为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：
①未刺激对照
激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
② 激活对照
激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
③同型对照
使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4、Fc受体阻断
使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience， 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5、荧光素的选择
检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ。
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