环氧合酶-2 (COX-2) ELISA使用说明

环氧合酶-2 (COX-2)简介

COX是一种膜结合酶，负责花生烯酸氧化生成前列腺素G2（PGG2）以及随后PGG2转变为PHG2。这是各种前列腺素生成的第一步。COX至少有两种不同的亚型，组成表达型COX-1，和诱导型COX-2。COX-1行使着看家功能，如血管止血，肾流血量，肾小球功能维护。COX-2存在于部分细胞内，发出炎症信号，如生长因子，细胞因子和内毒素。

环氧合酶-2 (COX-2)实验原理

试剂盒采用夹心酶免法，采用了两种高特异性抗体，TMB作为着色剂，最终溶液所显示的颜色强度与样品中COX-2的量成正比

检测范围

1.09~70ng/mL

环氧合酶-2 (COX-2)预期用途

1.       试剂盒可用于细胞上清裂解液中人COX-2的检测

细胞培养液

1）    将细胞培养液（1x10⁵~1x10⁷个细胞）加入至0.5ml的IBL裂解液中（货号为#19022）

2）    在振荡器上混匀或用移液枪吹打混匀

3）    2-8℃下旋转30min使其溶解

4）    2-8℃，10000rpm下离心10min

5）    有必要的话用EIA缓冲液稀释上清液

2.       细胞裂解液试验中，建议所用细胞数应一致

3.       建议总蛋白浓度也同时检测，可检测到人COX-2与总蛋白的关系

环氧合酶-2 (COX-2)试剂盒组成

1.       微孔板，96孔，包被有抗人COX-2鼠IgG单抗

2.       酶标抗体浓缩液，30X，HRP标记的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml

3.       标准品，重组人COX-2，0.5mlx2

4.       EIA缓冲液，30ml

5.       酶标抗体稀释液，内含的1%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液，12ml

6.       显色剂，TMB，15ml

7.       终止液，1N硫酸，12ml

8.       洗涤缓冲浓缩液，50ml，40X，0.05%吐温20的磷酸缓冲液

环氧合酶-2 (COX-2)操作指南

实验所需器材但试剂盒不提供

1.     酶标仪（450nm）

2.     微量移液器和取样吸头

3.     带刻度的量筒与烧杯

4.     蒸馏水

5.     温育器（37℃±1℃）

6.     冷床箱（4℃）

7.     坐标纸（log/log）

8.     吸水纸

9.     用于稀释标准品的试管

10.  洗涤瓶

11.  酶标抗体稀释的一次性试管

准备

1.       洗涤缓冲液制备：先将洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内，并于2周内用完

2.       标记抗体的制备：用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍，即得。

例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体浓缩+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔加100ul）

此步骤在实验前完成

剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，保存在4℃

3.       标准品的制备：吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到140ng/ml的人COX-2标准品

4.       标准品的稀释：准备8个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液

每管的浓度如下

1号管                 70 ng/ml

2号管                 35ng/ml

3号管                 17.5ng/ml

4号管                 8.75ng/ml

5号管                 4.38ng/ml

6号管                 2.19ng/ml

7号管                 1.09ng/ml

8号管                 0pg/ml（试验样品空白）

吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管，依次连续稀释，标准品范围为70~1.09ng/ml

5.       样品稀释：样品用EIA缓冲液稀释

实验步骤

使用前，所有样品应平衡至室温，大约30min，然后充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行

1.     确定好空白孔，并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。

2.     确定好样品对照孔，检测样品孔和标准品孔，然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。

3.     盖板，37℃孵育60min

4.     用洗瓶洗板，在微孔中加入洗涤液再浸泡15-30秒，弃取洗涤液。重复7次，最后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时，用洗板机洗四次后，再用洗瓶洗3次。

5.     每孔加入100ul酶标抗体。

6.     盖板，4℃下温育30min

7.     按照步骤4）洗板9次

8.     将所需量的显色剂加入到试管中，然后每孔内加入100ul显色剂。为了避免污染，请勿将剩余试剂倒入显色剂原装瓶中。

9.     室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色

10.  每孔中加入100ul终止液，此时溶液颜色会变成黄色。

11.  除去包被板孔底的杂质或水滴，同时确保液体表面无泡沫， 30min内在450处读取OD值。

特别注意

1.     样品采集后应立即检测，如需贮存的，则应放置在冰冻条件下，避免反复冻融，检测前应在低温下将其溶解并完全混合

2.     如有需要，样品可用EIA缓冲液稀释

3.     建议试验样品和标准品做双份检测

4.     试验样品应在中性PH范围内，有机溶剂的污染会影响试验

5.     只能使用试剂盒内提供的洗涤液洗板，洗板不充足可能会导致试验失败

6.     彻底倒去洗涤液，吸水纸上拍干，不能用吸水纸擦拭微孔

7.     底物液应避光保存，因其对光敏感，且要避免接触金属

8.     加入终止液后30min内读数

结果计算

绘制标准曲线前，将所有的检测孔（包括标准品和未知样品）的OD值都减去检测样品空白孔的OD值。在对数坐标纸上，以标准品的OD值（减去空白后的值）对其相应的浓度，通过这些点作一条平滑的标准曲线。我们可以从标准曲线上读取未知样品的浓度值。

典型标准曲线

附：采用全自动酶标仪检测，只需检测前设置好酶标仪的相关参数，如坐标参数（线性，半对数）和计算方式参数（三次回归、四参数或双对数曲线方程），即可直接得到结果