ASA抗精子抗体ELISA试剂盒使用说明（二）

c）质控血清，在每支冻干的质控血清中加入1ml即用型的洗涤液。

4.3.4酶联物，在15μl浓缩的酶联物中加入9ml稀释液，混合均匀。

4.4准备好试剂的储存与稳定性

4.4.1配置好的洗涤液在2-8℃的环境下可稳定存放4周。冷藏时溶液会出现磷酸盐沉淀物，室温下又会溶解。

4.4.2样品稀释液，配置好的稀释液在2-8℃的环境下可稳定存放2天，如果冻存于-20℃的环境下则可存放更长时间。

4.4.3标准品、质控品，应在每次实验时临时配置，并且仅能使用一次。

4.4.4酶联物，配置好的酶联物可在室温下稳定存放20min。

4.5试剂盒的处理

按照国家官方条理处理试剂盒，具体信息请见产品的材料安全数据单。

4.6破损试剂盒的处理

如果试剂盒有破坏的请与IBL公司联系或是提交您的投诉单，但自您拿到试剂盒后最迟不超过一个星期。严重破损的成分不能用于实验，将其保存好直至找到最终的解决办法。之后，按照官方条例将其处理掉。

5、样品

5.1采集

血清：按照一般原则进行静脉采血。不要使用明显溶血、黄疸血和脂血样品。

精液：精液样品应当用1000的转速离心15分钟，之后用上清做实验（精液）。

5.2储存

血清、精液：采集的样品存放于2-8℃的环境下时，必须在24小时内将其检测掉。如果想将血清存放更长时间，可以将血清冻存于-20℃的环境下，避免反复冻融。

5.3预处理

血清、精液：用稀释液将病人样品按1：51的比例进行稀释（例如：10μl样品+500μl稀释液），混合均匀。

6、实验步骤

一般注意事项：实验开始前，应当将所有的试剂和样品都平衡到室温。所有试剂混合时都应避免泡沫产生。为了避免交叉反应，每份试剂、标准品和样品都应使用新的取样吸头。在实验开始前，我们建议您将所有的试剂都准备好，将盖子移去，将所需数目的板条置于板架上等。这些准备工作可保证每一加样步骤间的时间间隔相同并且无中断。将所需数量的板条固定到板架上准备加样。

6.1实验步骤

6.1.1加100μl标准品、质控品和样本于相应反应孔中

6.1.2封板后37℃温育60分钟。

6.1.3每孔用300μl洗涤液洗板3次（建议您使用洗板机），吸水纸上拍干。注意：洗板步骤是否操作正确会明显影响实验的灵敏度和精密度。

6.1.4在每一微孔中加入100μl酶联物。

6.1.5封板后37℃温育60分钟。

6.1.6每孔用300μl洗涤液洗板3次

6.1.7在每一微孔加TMB底物液100μl。

6.1.8室温（18℃-24℃）温育10-15分钟。

6.1.9每孔加50μl终止液以终止底物反应，轻轻振板以使溶液混合均匀。

6.1.10加终止液后30min内在450nm读取OD值。（参考波长：600-650nm）

6.2结果计算

标准品、质控品和病人样本结果的计算：

在双对数坐标纸上，以标准品的OD值对标准品浓度作一条标准曲线。用标准曲线计算未知样品（已稀释）总的抗精子抗体浓度（mIU/100μl）。最后将结果乘以0.5便得到未稀释样品的浓度（U/ml）。

                     50（稀释因子）×10（100μl转换成1ml的转换系数）

                           1000（mU变成U的转换系数）

自动计算：

用三次回归、四参数或双对数方程做标准曲线图一般都可以获得较好的效果。至于结果的准确度请件第7项（实验特性）。样品中抗体浓度高于最高标准品的应当用相应的稀释液稀释并重新检测。最后将结果乘以相应的稀释因子即可。

下面是抗精子抗体ELISA试剂盒标准曲线的一个典型范例：

6.3自动检测

IBL公司的实验室以证明：抗精子抗体ELISA试剂盒可用全自动酶免分析仪来做。操作说明可直接向IBL索取或从IBL公司的主页上下载。具体信息请将“自动检测”项。