实验步骤

将所有的试剂成分和样品都平衡至室温。实验前反复倒置以混合试剂和样品。

试剂准备：

1）1X洗涤液的配制：用生物学或高纯度水将10倍浓缩型的洗涤液稀释成1X的洗涤液。为了制备即用型的洗涤缓冲液，我们可以将120ml 10倍浓缩的洗涤液加入到1080ml蒸馏水或去离子水中，冲洗掉所有晶体，旋涡混合溶液以至所有晶体都溶解掉。制备好的洗涤液可在室温下稳定储存6个月。使用前请检查洗涤液是否被污染。

2）包被板的准备：将实验所需数目的板条置于板架上。将剩余的板条立即装入包装袋中，并储存于2-8℃的环境下，有效期内稳定。
操作步骤：

1）阳性质控、阴性质控都必须做双份检测,DENRA和NCA都要检测，未知血清样品可做一份或双份，DENRA和NCA都要检测，按照说明书上的操作流程图进行操作。

2）将实验中使用的板条标记好。

3）用试剂盒提供的样品稀释液将血清和质控品稀释100倍。用小聚丙烯试管进行稀释，稀释时至少需要4ul血清、阳性质控和阴性质控。如：4ul血清加396ul稀释液。

4）用单道或多道移液器将稀释好的血清、阴性质控和阳性质控各50ul加入到相应的微孔中。注意，所有的样品都必须用DENRA和NCA检测。

5）用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。

注意：这样是为了保证温度的分布在每个孔的底部和边缘同等地散播。一旦顶部密封阻碍了蒸发，任何多余的封板胶必需被剪掉。

6）37℃下孵育1小时。注意：不要将微孔板叠放，必须单独地分层平辅。这对于温度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何气体，不要让板条接触任何湿润的物质，如湿纸巾等。

7）温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。

9）用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）

10）            37℃下孵育1小时。（同步骤6）

11）            温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

12）            用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP标记的酶联物。

13）            用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）

14）            37℃下孵育1小时。（同步骤6）

15）            温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

16）            用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。

17）            室温下温育（无需盖板）5min。

18）            温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。

19）            用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。

20）            室温避光温育10min。

21）            温育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul终止液，室温温育1min。

22）            温育后，450nm处测    OD值。

登革热IgM ELISA实验操作流程图：

室温温育1min