7、实验所需器材（但试剂盒不提供）
1） 移液器（10；10-100；100-1000μL）
2） 轨道摇床（200-900rpm）
3） 旋涡混合器
4） 带储器的8通道移液器
5） 洗涤瓶，自动或半自动包被板清洗系统
6） 酶标仪
7） 双蒸水或去离子水
8） 吸水纸，取样吸头，计时器
8、实验前说明
注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成两次进行,下列所述体积为做48人份时所需要的量。 |
8.1样品的稀释
如果样品中去甲肾上腺素浓度高于最高标准品的应按照下列所述进行稀释：
样品 | 待稀释 | 稀释液 | 备注 |
血浆 | 去甲肾上腺素浓度高于最高标准品中去甲肾上腺素的浓度 | 双蒸水 | 提取步骤前 |
尿液 | 去甲肾上腺素浓度高于最高标准品中去甲肾上腺素的浓度 | 0.1N的HCl | 提取步骤前 |
8.2样品、标准品和质控品的提取（提取板，手动操作版）
1） | 将标准品、已稀释好的质控品、已稀释好的尿液样品各20μL和500μL血浆样品加入到提取板相应的微孔中。除血浆样品孔外，在所有的微孔中加入500μL双蒸水以消除体积差别。 |
2） | 在每一微孔中加入1000μL提取缓冲液 |
3） | 盖板。在轨道摇床（600-900rpm）上18-25℃的环境下提取30min。在提取过程中，液体的表面应该会浸湿粘性金属板，但液体的量不能超过微孔的2/3。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
4） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
5） | 每孔加入2ml双蒸水 |
6） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
7） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
8） | 每孔加入150μL提取缓冲液，再向每孔中加入50μL酰化试剂，立即混合均匀。 |
9） | 在轨道摇床（400-600rpm）上18-25℃的环境下提取20min。（无需盖板） |
10） | 快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
11） | 每孔加入2ml双蒸水。 |
12） | 用新的粘性金属板盖板。在轨道摇床上（600-900rpm）18-25℃的环境下振荡5min。液体是否溅出并不会影响实验结果。 |
13） | 移去粘性金属板，快速弃取孔内反应液，在吸水纸上拍干。 |
14） | 每孔加入300μL Release缓冲液。 |
15） | 在轨道摇床（400-500rpm）上18-25℃的环境下振荡30min。（无需盖板） |
已准备好的样品应当在当天就进行检测。如果不行的话，您可将提取板用粘性金属板盖好，在2-8℃的环境下可存放一夜。
9、实验步骤
9.1 COMT酶溶液的准备
注意：COMT酶溶液应在使用前直接临时配置。 |
在COMT冻干粉中加入1.25ml双蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶联溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加剂以充分混合溶解的COMT试剂*，COMT酶溶液最后的体积为每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋涡混合器混合，但要避免气泡产生，配置好的COMT溶液可在室温下稳定存放1小时。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，则剩余的COMT溶液应立即冻存于-20℃的环境下。COMT溶液可在此环境下稳定存放1-2个月。
9.2样品、标准品和质控品的酶分化
注意 | 如果要检测肾上腺素和去甲肾上腺素，我们建议您先检测肾上腺素。如果使用自动置换型衣液器加样，请将取样吸头内的残余液体加入到提取板的相应微孔内，否则剩余的提取液不够去甲肾上腺素检测用。将提取板放到有一定坡度的位置上。实验开始前，确定好肾上腺素和去甲肾上腺素的检测孔并标记好。 |
9.3尿液与血浆中的去甲肾上腺素
1 | 在每一微孔内加入25ul临时配制的COMT酶溶液，轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
2 | 将提取好的标准品、质控品和样品分别25ul加入到相应的微孔内。在此步骤中，我们可以将取样吸头直接深入到COMT溶液里。加样后，溶液颜色变成粉色，轻轻振板以使溶液混合均匀。 |
3 | 向每一微孔中加入50ul去甲肾上腺素抗血清（蓝色）。 |
4 | 盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25℃的环境下孵育120min。 |
8.4冻干粉或浓缩成分的准备
稀释 | 成分 | 稀释液 | 比例 | 备注 | 贮存 | 稳定性 | |
20ml | 洗涤液 | 180ml | 双蒸水 | 1：10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
60μL | 酶联物 | 6ml | 洗涤缓冲液（已稀释好） | 1：101 | 临时配置，仅能使用一次，混合时避免气泡产生 | 18-25℃ | 30min |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物缓冲液 | 临时配置，仅能使用一次 | 18-25℃ | 10min |
9.5 ELISA实验步骤
1） 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300ul稀释好的洗涤液洗板4次。最后在吸水纸上拍干以除去残余液体。
2） 在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶联物。
3） 盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25℃的环境下孵育60min。
4） 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250-300ul稀释好的洗涤液洗板4次。最后在吸水纸上拍干一除去残余液体。
5） 如果可以的话，使用8道移液器加底物液和终止液。加底物液和终止液的时间间隔应当相同，使用自动置换型移液器并避免气泡产生。
6） 在每一微孔中加入200ul底物液。
7） 不要盖板，在轨道摇床上（400-600rpm）18-25℃的环境下孵育60min。
8） 在每一微孔内加入50ulPNPP终止液以终止酶反应。轻轻振板以使溶液混合均匀。
9） 加终止液后60min内405nm处读取OD值。
10、期望值
实验结果不能当作判断任何治疗结果的唯一因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值（5%-95%），建议每个实验室读确定自己的正常值范围：
尿液 | 血浆 | |||
μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
去甲肾上腺素 | ＜90 | ＜535 | ＜600 | ＜3.55 |
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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