试剂和材料:
1. 培养基:含2mmol/L的左旋谷氨酰胺的IMDM,添加1%牛血清白蛋白,10μg/ml胰岛素,0.1mmol/L 2-巯基乙醇,50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素;
2. 48孔培养板;
3. 0.05%胰蛋白酶,含EDTA;
4. 纤维粘连蛋白(fibronectin)包被的细胞基质支架;
5. 细胞因子(干细胞因子,IL-6,IL-3,Flt-3配体);
实验方法:
1. 用含细胞因子的培养基重悬细胞(100ng/ml干细胞因子,20ng/ml IL-6,20ng/ml IL-3和100ng/ml Flt-3配体);
2. 将2.5×105 CD34+细胞/ml接种到纤维粘连蛋白包被的48孔培养板;
3. 每周两次半量更换新鲜培养基;
4. 两周后收集细胞;
(1)250g离心10min,从三维细胞基质支架中收集非贴壁的细胞;
(2)贴壁的细胞用0.05%胰蛋白酶/EDTA孵育细胞基质,37℃孵育30min,随后250g离心10min;