DNA测序技术的现状和发展（四）

1.1.3.2 模板制备程序

完全的体外大规模模板制备工作是达成高通量、低价格测序技术的前提。已广泛使用的乳液PCR扩增技术就是一种很好的方法。不过，由于很难在热循环测序反应中保证乳液微滴的稳定性，因此最开始实验的模板扩增方法是恒温扩增法（isothermal）。
乳液PCR不需要借助细菌的帮助就能扩增模板，虽然这一点非常诱人，但最开始时并没有合适的表面活性剂能帮助乳液在热循环过程中保持稳定。于是出现了恒温扩增法，即滚环扩增反应（RCA）。虽然滚环扩增反应的产量非常高，但这些产物中大部分都不能用来作为测序模板。因此，还需要找到一种不需要细菌扩增，能用于有限稀释的模板扩增新方法。于是，人们又把目光转回了PCR法。在RCA法中，首先将模板克隆有限稀释之后置入光纤玻片上的小孔中，然后用橡胶衬垫把光 纤玻片封闭起来，将玻片放入传统的平顶PCR仪进行扩增。这种方法取得了成功，但是效率不高，因为在玻片中的热质量（thermal mass）和它的钳效应（clamping mechanism）需要更长的PCR循环时间，而且模板的有限稀释度不能低于10%。孔与孔之间的相互污染现象也是一个不容忽视的问题。不过无论如何，该方法还是第一个首先从全基因组文库中扩增模板然后使用非Sanger、非Gilbert测序法对基因组进行从头测序的方法，也是第一个使用体外模板扩增 技术进行全基因组（腺病毒基因组）测序的方法。

乳液滴的热稳定性问题最终通过加入用于制造炸药的表面活性剂得到了解决，于是乳液PCR技术马上在众多新一代测序仪中得到了广泛的应用。因为乳液 PCR技术具有高效性、可扩展性，既能从30Kb的腺病毒基因组中扩增模板，也能从好几Mb的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）基因组中扩增模板。

随着测序精度、测序长度、乳液滴稳定性等各方面技术的不断发展，454测序仪已经不仅仅用于对细菌级别的基因组进行测序了，还能对更高级、更复杂的生物基因组进行测序，例如现代人类基因组、尼安德特人基因组以及环境基因组等。

1.1.3.3 文库制备

文库制备包括以下几个步骤，首先随机切割样品基因组，获得大量DNA片段，然后接上接头进行扩增反应。454测序仪的样品制备程序和Craig Venter等人的鸟枪法样品制备程序有着本质的差别。454公司采用的是如图4中所示的有限稀释、乳液PCR扩增法，而没有鸟枪法中的细菌克隆繁殖步骤。去掉了细菌繁殖步骤极大地提高了整个测序工作的速度和效率，同时避免了由于细菌繁殖导致的序列丢失的可能性。这种方法同样对古老DNA和代谢基因组学的研究也非常适用。末端配对文库制备方法的建立同样帮助454测序仪获得了对复杂基因组从头测序、对重复片段测序以及对基因组结构（复制、重排）展开系统研究三种能力。这种末端配对文库的制备方法是受到了Bender科研小组对果蝇（Drosophila）制备跨步文库（jumping library）方法的启发而发展得来的。

1.1.4 应用范围

随着越来越多重要的研究领域受到测序技术的影响，454公司开始和其它商业和学术机构开展合作，进行样品测序和分析工作。这些合作项目又进一步验证 了454测序仪使用的技术能够在众多领域中发挥作用，例如末端配对文库技术对于研究基因组结构的作用和乳液PCR技术捕获目的DNA片段的作用等。

1.1.4.1 细菌基因组测序和比较基因组研究

为了测试454测序仪在全基因组测序方面的能力，454公司一开始就参与了一项合作项目，该研究项目会对4株结核分支杆菌基因组进行测序，这四株结核分支杆菌分别是一株对R207910具有耐药性的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）菌株，基因组大小约4Mb；两株对R207910具有耐药性的耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis），基因组大小约6Mb；以及一株正常的耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis），基因组大小约6Mb。他们希望能发现结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对R207910产生抗药性的机制。该项研究清晰的展现了454测序仪在测序速度和测序精度方面的优势。使用传统的 Sanger测序法对一个4Mb的基因组和3个6Mb的基因组进行测序需要好几个月的时间，而用454测序仪，在只有一位实验人员参与实验的情况下，包括样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周。而且使用454测序仪还避免了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出现的错误，获得了高质量的测序结果，发现了导致 结核分枝杆菌对R207910产生抗药性的两个点突变位点。这项研究成果让我们在最近的40年内第一次找到了特异性治疗结核病的药物，同时也对454测序 仪在细菌基因组测序方面的应用价值有了深刻的体会。随后，454测序仪又参与了比较基因组学研究项目、对高致病性细菌空肠弯曲菌 （Campylobacter jejun）基因组的从头测序项目、对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）在慢性胃炎致病过程中的进化研究项目、从南极海冰细菌（Antarctic sea ice bacterium）中新发现冰结合蛋白（ice-binding protein）并对其测序的研究项目，以及在引起肺炎、脑膜炎和泌尿道感染的细菌中发现致病因素的研究项目等。

由于454测序仪不会因为细菌克隆产生测序误差，所以在对结核分枝杆菌抗药性的研究中表现出了非常强的发现突变位点的能力，这一点也被后来的其它研 究项目所证实。此外，最近在用454测序仪进行的人类基因组测序项目中发现了长达29Mb的片段与人类基因组参考序列build-36不相符，这些片段被 认为是参考序列中不存在的序列，属于基因组中的常染色质部分。不过，还需要注意的是，有些报道称由于重复片段的存在会出现序列组装错误，而且小模板片段雾化（nebulization）处理这种方式也会造成测序错误出现。

1.1.4.2 小RNA测序

对于包括miRNA在内的小RNA的研究兴趣从2005年开始就持续不断升温，而2005年恰好也是454测序仪上市的那一年。454测序仪以其不 需要进行传统的细菌克隆步骤和足以覆盖只有21bp长的miRNA的测序长度等优势，很快就在miRNA的作用研究之中占据了一席之地。454测序仪最早 参与进行的miRNA研究是对拟南芥（Arabidopsis thaliana）miRNA开展的研究。随后马上又参与了另一项研究项目，在这个项目中我们在小鼠体内发现了一种新型的小RNA——piRNA。这些研 究项目为我们在人类、黑猩猩、斑马鱼和肿瘤细胞系中开展小RNA研究铺平了道路。454测序仪具有的这种对小RNA进行研究的能力使它在众多有关RNA的 研究领域都能有所作为，例如转录体研究领域、EST研究领域、5’-RATE研究领域和基于转录体的SNP研究领域等。

1.1.4.3 在古生物学和古DNA研究领域的作用

要用传统的测序方法对尼安德特人的基因组进行测序研究非常困难，因为这些古老DNA量非常少，而且都早已裂解成了片段。一开始，454公司使用比较 容易得到的不太重要的古代DNA样品检验了454测序仪对它们的测序能力，结果非常好，尽管当时454测序仪的测序长度只有100bp。不过，尼安德特人 的基因组片段长度基本上都介于40bp~90bp之间，而且最近开发的乳液PCR方法也能够对微量（单分子）样本进行很好的扩增。于是，454测序仪参与 了对38,000年前古老的尼安德特人的基因组进行测序的工作，研究结果分别发表在了好几篇论文当中，引起了广泛的关注，并促进了古生物学基因组的研究。 随后有人对长毛象（woolly mammoth）和更新世狼（Pleistocene wolves）的基因组开展了测序研究。

1.1.4.4 环境基因组学和感染性疾病研究领域

美国在2001年爆发了炭疽恐怖袭击危机之后，454公司便对如何使用454测序仪对复杂的、未知的、未人工培养的环境微生物基因组进行测序展开了研究。前后两个合作研究项目均表明454测序仪能够用于从DNA混合样品中发现未知微生物并对其进行分类。在第一个研究项目中，有三名患者都接受了同一名 澳大利亚器官捐赠者的器官，之后均因不明原因而死亡。从这三名死者身上提取了非人类DNA样品进行测序，结果获得了144,000条序列。分析后发现，这些序列分别属于一种沙粒病毒科（Arenaviridae）家族病毒的14个不同基因。随后进行的第二项研究在对健康蜂群和患病蜂群进行环境基因组学比较研究之后发现，以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus）是导致蜜蜂蜂群崩溃症的元凶。上述这些研究都突出了454测序仪的一个特点，即在样品准备前不需要进行克隆或预扩增步骤，因此非常适用于对未知的未能人工培养的物种进行测序。这些特点也在其它对地下矿藏、深海、土壤和高盐等环境下进行的环境微生物构成方面的研究所证实。

1.1.4.5 基因组结构研究领域

454测序仪技术的进步使它能够适用于更多的科研领域。最新开发的末端配对测序法（paired-end sequencing）就非常适合用于发现人类基因组当中的结构变异。末端配对作图过程（paired-end mapping），简单来说就是对一个非洲人和一个欧洲人的基因组进行测序后发现结构变异并对其作图，最终将1,000多个3Kb或更长的结构变异片段定 位到人类基因组参考序列中。研究发现，在人类基因组当中存在的结构变异远远超过了人们的预计，其中有很多变异都会造成非常重要的表型改变。这项对诺贝尔奖得主James Watson基因组进行测序的项目和其它相关研究，一起使得“人类基因多样性（human genetic variation）”这一科学命题成为了《科学》（Science）杂志的年度重大科技突破。

1.2 Illumina测序仪

Illumina测序仪通常也被称作Solexa测序仪（Illumina测序仪的特点见表5）。它适用于采用各种方法制备的DNA文库，文库中DNA片段可以长达数百bp，并可通过桥式PCR来扩增模板片段（图5b）。在桥式PCR反应中，正向引物和反向引物都被通过一个柔性接头（flexible linker）固定在固相载体（solid substrate）上。经过PCR反应，所有的模板扩增产物就都被固定到了芯片上固定的位置。

值得注意的是，Illumina测序仪使用的桥式PCR与传统的桥式PCR有所不同，它会交替使用Bst聚合酶进行延伸反应以及使用甲酰胺 （formamide）进行变性反应。这样，经过桥式PCR扩增之后，也会在固相载体上形成一个个的模板“克隆”。一块芯片的8条独立“泳道”上每一条泳道都可以容纳数百万的模板“克隆”，这样一次就可以同时对8个不同的文库进行测序。

经过上述PCR扩增步骤之后，所有的模板都被线性化处理（linearization）而形成单链模板，接着与测序引物退火、杂交。随后使用修饰的 DNA聚合酶和四种核苷酸混合试剂进行单碱基延伸测序反应（图6b）。这些核苷酸试剂都经过两种方式处理过，它们都是可逆的终止子（reversible terminator）。这些核苷酸的3’羟基端都有一个可被化学法切除的基团，这样每一次反应都只会掺入一个核苷酸，同时每种核苷酸都标记上了可被化学 法切除的不同颜色的荧光基团，以标识每种碱基。经过一轮单碱基掺入反应采集到信号之后，就可以通过化学方法切除上述被掺入核苷酸上标记的两个基团，然后就 能够继续掺入下一个核苷酸，重复测序反应了。这种测序方法对36bp长度的序列测序准确率是非常高的，不过如果处理更长的序列，准确率就会有所降低了。