虽然这些最初的纳米孔实验并没有获得预期结果，但它们至少显示出纳米孔在单分子技术方面的应用优势，例如高度的敏感性，同时也带动了纳米孔核酸分析技术的研究热潮，并在理论及实验方面取得了一些成果。自从发现在电场力作用下，长达1000个碱基的单链DNA分子也能通过纳米孔之后，人们就更加坚信， 廉价的纳米孔测序技术一定会成为现实。与此同时，与纳米孔有关的研究更是大大增加。曾有人使用液态双分子层（lipid bilayer）构建蛋白质孔道，最近还出现了固态材料或塑料材料的纳米孔道。事实上，一直为10年内完成1,000美元检测个人基因组这一目标努力的美国国家人类基因组研究所（NHGRI），已经给纳米孔测序研究提供了好几笔经费了（详见http://grants.nih.gov/grants /guide/rfa-files/RFA-HG-04-003.html，图9）。
尽管纳米孔技术是好几项单分子应用技术的基础，但DNA链具有的长度还是成为采用纳米孔技术进行测序的一个障碍。此外，随着目前合成测序法 （sequencing by synthesis, SBS）技术正在不断发展，并且费用越来越低，那是否还有必要继续研究纳米孔测序技术呢？这也正是目前大家对纳米孔测序技术的一个疑问，人们希望更多领域的科学家和研究人员可以共同参与讨论，提出合理的解决方法。
1. 纳米孔测序技术的特点
纳米孔测序技术一个最突出的优势就是便宜，尤其是在样品准备阶段几乎不需要耗费什么试剂，而且也不需要像别的测序方法那样使用核苷酸、聚合酶或连接 酶等等。因此，纳米孔测序技术要比传统的直接测序（direct strand sequencing）、Sanger合成测序法或其它方法的费用低得多，也比最近开发出的大型高通量测序仪，如罗氏公司的454、Illumina公司 的Solexa、Applied Biosystems公司的SOLiD、Helicos公司的HelioScope等要便宜。与上述所有技术都不同，纳米孔测序技术根本无需纯化的荧光素试剂，也无需进行DNA扩增，因此不仅省去了试剂的费用，还省去了克隆、扩增的时间，真正做到了省时又省钱。
一台理想的使用电检测技术的商业化测序仪需要由以下两个部分组成：一次性的检测芯片（disposable detector chip），该芯片整合有纳米孔芯片、微流体系统、电子探针系统等；以及一套可以控制试验操作并分析试验数据的便携式工作系统。假设一个芯片能对一个人的 全基因组进行测序，那么这一次检测的费用就只包括制备DNA样品的费用、设备使用费和一次性芯片的费用。
理论上说，使用纳米孔测序仪只需要用不到1μg（即从不到106个细胞中提取的不到106个基因组拷贝）的基因组DNA样品就可以获得六倍的序列覆盖量。不过，在实际操作过程中可能需要108个基因组拷贝，这样才能保证在25μl~50μl的操作体系中达到足够的检测浓度。
人类108个基因组拷贝大约相当于700μg人类二倍体基因组组织，这点DNA可以用商业化的试剂盒直接从血液等组织中抽提出来，抽提一次的费用只需要不到40美元。
在纳米孔测序过程中，长约6×109的二倍体哺乳动物基因组会被分割成长约50,000碱基的单链DNA分子分别进行测序。这种一次检测50,000个碱基的能力大大方便了后续序列拼接阶段的工作。如果纳米孔测序技术真的能够只需要一点点样品，同时还不需要对样品进行标记等操作的话，那么检测一次的费用就只包括芯片的费用和仪器使用费，这绝对不会超过1,000美元。不过，要实现这一美好的目标，目前还存在几个问题需要克服。
2. 发展纳米孔测序技术可能会碰到的问题
现在，基于纳米孔技术已经发展出了好几种检测碱基的方法。下面将列举几种，目的不是介绍测序方法，而是为了详细说明纳米孔测序技术会碰到的主要问题。
当单链DNA穿过生物纳米孔道或固态纳米孔道时检测电流。尽管如上所述，已经有试验清楚证明了可以通过检测电流强度改变的情况来区分不同的多聚核苷酸分子，但到目前为止，还没有一种生物纳米孔或人工纳米孔能有一个非常合适的几何学结构，可以让人们在多聚核苷酸分子穿过纳米孔时检测单个核苷酸造成的电 流改变。人们目前可用的这些纳米孔都太长，没有一个长度短于5nm，而太长的纳米孔通道会造成一次有10~15个碱基的单链DNA分子穿过，所以无法对单个碱基分子进行检测。即使“无限短”的通道也无法达到所需的分辨率，这是由于电场区域决定了通道电子读出的区域，电场区域会向通道两侧各扩展大约一个通道 直径的长度。因为纳米孔的直径要能允许单链DNA分子（直径约1.5nm）通过，而电流的分辨率只能达到3nm，这就决定了只检测电流强度的变化无法达到 “空间”上的分辨率要求。而且单链核苷多聚物在150mV的电场中，以大约1个核苷酸/μs的速度通过纳米孔。但是要达到在皮安（pA）电流水平上检测单 个核苷酸的精度就需要延缓单链核酸分子通过纳米孔的速度，至少要超过1msec以上。
虽然使用纳米孔无法区分DNA链中相隔仅0.4nm的相邻核苷酸，但如果纳米孔技术和杂交测序技术结合起来，那么测得的粗略的电流改变信息就能用于核酸分子测序。所谓杂交测序，就是通过大量已知序列的探针与待测样品杂交，然后根据产生的杂交图谱排列出靶DNA的序列。不过在杂交测序时，与待测样品结 合的探针的位置和数量都必须弄清楚，但是仅靠杂交测序是不能得到这些信息的。而纳米孔测序技术就很容易区分单链DNA和双链DNA了，所以也就能很好地判 断被探针杂交的位置和数目。因此，如果能将这两种技术结合起来，就能实现准确的测序了。实际上，这也正是杂交辅助纳米孔道测序技术 （hybridization-assisted nanopore sequencing, HANS）的原理。不过，目前HANS技术还存在两大问题（表12）。
依次从DNA链末端切割碱基，以检测这些碱基逐个通过纳米孔道时引起的电流变化，用这种新方法来测序。Keller等人当初认识到可以使用核酸外切 酶逐次水解DNA末端的脱氧单磷酸核苷（deoxynucleoside monophosphate, dNMP），然后逐个识别这些dNMP，这样就可以对DNA链进行测序了。但当时苦于没有好的办法确认这些未被标记的dNMP，所以阻碍了这种测序技术的 发展。现在，纳米孔技术的发展给这种测序技术带来了重生的曙光。研究发现，α溶血素与一个氨基化环糊精配体（aminocyclodextrin adaptor）结合之后（即在α溶血素孔道内共价结合上一个环糊精），就可以识别未被标记的碱基了。基于这项研究成果，英国牛津纳米孔技术公司 （Oxford Nanopore Technologies）最近成功地将一个氨基化环糊精配体共价结合到了α溶血素孔道内（图8b）。当一个dNMP通过固定于脂质双分子层中的α溶血素 氨基化环糊精孔道时，跨孔电流强度会发生四种改变，即每一种dNMP通过纳米孔道时都会引起一种特定形式的电流强度改变，因此，可以通过测量电流强度的改变来判断究竟是哪一种碱基（A、T、G、C）通过了纳米孔。另外，由于电流强度的改变非常明显（因为碱基堵塞纳米孔和未堵塞之间，电流强度差异特别大）， 所以也就可以准确的判断出有多少个碱基通过纳米孔了。现在，对于这种纳米孔测序技术来说，最重要的是如何保证被核酸外切酶依次切下来的碱基能100%依次 通过纳米孔。由于该方法采用纳米孔来识别释放的dNMP，而不是通过对完整的DNA链上的碱基进行鉴别，因此，这种逐次“阅读”碱基的方式能否如实反映 DNA链中碱基的真实顺序就显得尤其重要了。最后，选择哪种核酸外切酶也是很重要的一步。可以采用将核酸酶和α溶血素基因剪接在一起的重组片段，或者采用 化学方法将核酸酶与α溶血素结合在一起，从而确保释放的dNMP能够通过纳米孔。这种核酸外切酶应该具有可持续性、检测时低噪音，以及同时能在高盐环境下工作的特性。最好这种核酸外切酶能够切割基因组双链DNA，而且易于操作。
纳米孔测序技术使用了信号转换技术和光学读出技术。纳米孔测序技术还有另一个发展方向，就是将DNA序列信息转换成两种颜色的图形信息，然后再通过 光学读出技术进行检测、分析。然而，要将荧光探针标记到DNA链中的每一个碱基上是非常困难的工作。于是人们开发出了一种新的方法，用两种不同的12碱基 寡聚体（12-mer oligos）——A和B，按照四种不同的组合方式（AB、BA、AA、BB）将A、B组合起来（图8c），这样就可以对DNA链中的每一个核苷酸进行替换了。因为单个核苷酸通过纳米孔的速度实在是太快了，完全无法进行检测，所以将单核苷酸替换成这种长一点的寡聚体，可以减缓通过速度，方便检测。同时，通 过这种信号转化还将DNA链中原本的四种信号A、T、G、C简化成了A、B两种信号。
挪威Lingvitae公司（http://www.lingvitae.com/DPTutorial.php）已经成功开发出了一种自动化的、 大规模并行处理方法。该方法可以在24小时内将一个人类基因组序列转化成由24bp寡聚体序列组成的“新”序列。现在，他们还在继续努力，希望能开发出更 便宜、出错率更低、寡聚体片段更长，同时耗时更短的信号转化方法。进行这种信号转化看起来是增加了一个步骤，这好像与纳米孔测序的初衷（不需要进行标记等 额外操作步骤）相悖，但实际情况是，由于增加了这个步骤极大地简化了后续的信号（序列）读取工作，而这点恰恰是令其它测序方法头疼不已的大麻烦。
使用两种能分别与A、B互补的12bp长的“分子信标”（molecular beacon）（详见http://www.molecular-beacons.org/Introduction.html，杂交过程见图10）与经 过上述信号转化之后形成的新DNA链杂交。分子信标由于自我猝灭（self-quenching）机制的作用，在溶液中的荧光背景信号极低（图8c）。
同样，当分子信标与新DNA链杂交之后，由于临近信标间存在相互猝灭作用，所以荧光信号依然很弱（图8c）。但当杂交链通过直径不到2nm的纳米孔 时，与新DNA链互补结合的寡聚体会脱落，并释放出荧光信号，只需依次检测这些荧光信号就能对原始DNA链进行测序。将高密度纳米孔芯片技术、光学读取技 术、高分辨率电子倍增电荷偶联摄像技术（high resolution electron-multiplying charge-coupled device camera）结合起来，就可以同时并行处理大量数据，大大提高测序速度。由于纳米孔不需要借助电子吸附（electrical contact）、表面修饰（urface modification）或转位过程（translocation process）等步骤就可以装载到芯片上，因此可以得到极高密度的纳米孔芯片。现在的纳米加工技术（nanofabrication）已经可以达到上述 要求了。不过，目前要生产出直径在1.7nm~2.0nm的高密度纳米孔芯片还存在一定困难。
当单链DNA通过嵌有探针的固态纳米孔时检测横向隧穿电流或电容。有这样一种理论认为，当单链DNA通过嵌有探针的固态纳米孔时，通过每一个碱基的 横向电流都各不相同，故根据电流情况判断出是哪种碱基通过，也就能对ssDNA进行测序了（图8d）。这种方法与前面所述的因为每种碱基堵塞了纳米孔道导 致电流减小的幅度不同来对碱基进行判断的方法不同，它是检测横向装载在纳米孔道中的一对电极对通过纳米孔的碱基施加的横向电流来判断究竟是哪种碱基通过 的。虽然在试验中该方法的效果很不错，但是还是要介绍一下有关该方法的几种不同观点。
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