摘要：一种α-牛乳清蛋白和两种β-牛乳清蛋白标准分别用超纯水稀释配制，采用ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱分离，ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色谱检测。Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种乳清蛋白可达基线分离，线性范围为1.000-100.000mg/kg，复相关系数R2_0.999，方法的检出限为1.000 mg/kg。
关键词：超高效液相色谱 奶粉 牛奶 牛乳清蛋白 Bα-La Bβb-Lg Bβa-Lg
前言
乳清蛋白是牛奶中的主要蛋白质，乳清蛋白主要包括α-牛乳白蛋白（Bα-Lactalbumin，Bα-La）、β-牛乳球蛋白（Bβ-Lactoglbulin，Bβ-Lg）、蛋白酶-胨和牛血清白蛋白等，前两者是乳清蛋白的主要成分，分别占其总量的10-20%和40-50%，β-牛乳球蛋白包括Bβb-Lg和Bβa-Lg两个遗传变异体。[1-2]
乳清蛋白具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，已经被越来越多地应用于食品工业，市场上同时出现了不同种类和品牌的乳清蛋白保健品，如儿童营养蛋白粉、婴儿配方奶粉等[3]。但有报道乳清蛋白又是一种常见的过敏原，β-乳球蛋白是最主要的过敏原，α-乳白蛋白紧随其后[4]。UPLC以其1.7μm超细填料色谱柱和15000psi的超高效液相色谱系统，可以完美实现Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种乳清蛋白分离；尤其对于Bβb-Lg和Bβa-Lg两个遗传变异体可实现完全分离。以及配备高灵敏度Waters ACQUITY TUV紫外检测器，整个系统检测三种乳清蛋白检出限达到1ppm。该检测方法可应用于牛奶或奶粉中α-牛乳白蛋白和β-牛乳球蛋白的定量检测。
实验方法
材料、试剂和仪器
乙腈为色谱纯，三氟乙酸为优级纯，Triton X-100，氯化钠（优级纯），实验用水为超纯水（18MΩ，TOC3ppb），牛乳清蛋白标准品Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg；ACQUITY UPLC®超高效液相色谱系统，配Acquity TUV检测器、FILTER MIXER （425μl，P/N 205000403）。
数据处理系统
Empower 2 中文版
前处理方法
称取0.20 g奶粉样品或2ml液态奶样品，添加8mL（对于液态奶添加6ml）0.3M 的氯化钠（含0.2%的TritonX-100）溶液溶解，震荡混匀；然后用0.3%的T FA水溶液调节pH至4.4-4.6之间（以沉淀酪蛋白，其等电点为4.6，需要认真控制pH，因为乳清蛋白的等电点为4.8），定容至10 mL，均质5分钟，室温静置1个小时左后，2500转离心10分钟，取上清液过0.2um滤膜。
结果与讨论
标准配制
三种乳清蛋白标准均用超纯水稀释，配制成不同浓度的标样进行检测，可得到较好色谱峰形，并且配制简单。
检测波长的选择
应用Waters PDA检测器扫描得到三种乳清蛋白的紫外吸收光谱图，如图1至3所示。
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