213 DNA 修复能力比较 以3H2TdR 参入法测定非程序性DNA 合成(UDS) , 以表示DNA 总修复能力. 从F ig. 3 可见, 在紫外线照射后12 h 左右UDS达峰值. 衰老2BS 细胞的修复能力明显低于年轻细胞(P < 0101).
214 斑点及Northern 印迹杂交结果分析 由斑点杂交结果可见, 紫外线照射6 h 后gadd 153 表达达峰值, 衰老细胞的gadd 153 可诱导性明显低于年轻细胞, 结果见(Fig. 4). 根据斑点杂交结果选取紫外线照射后6 h 收集细胞, 进行Northern 杂交, 结果显示(Fig. 5) , 紫外线照射后衰老细胞中gadd153、p 53、p 21 基因的可诱导性均明显低于年轻细胞, 但其中p 53 诱导性改变最小. 另外, 这三种基因在紫外线损伤前的基本表达在衰老细胞及年轻细胞中也有所不同, 其中p 21 在衰老细胞中的基本表达明显高于年轻细胞, gadd153 的表达在衰老细胞中似略高于年轻细胞, 而p53 的表达差异不显著.
3 讨论
细胞衰老是一个多因素、多途径所致的复杂结果,DNA 损伤的积累及修复能力的下降可能是细胞衰老的重要原因之一[8] , 在DNA 受损后衰老细胞应答与年轻细胞有所不同. 衰老细胞的形态及增殖曲线的改变不明显, 同时其恢复也缓慢. 流式细胞计检测结果显示, 衰老细胞G1 期阻滞率的增加幅度低于年轻细胞; 同时衰老细胞的DNA 修复能力显著低于年轻细胞. 这些结果都说明衰老细胞对于DNA 损伤的应答能力明显不如年轻细胞. 那么, 衰老细胞对DNA 损伤的应答能力下降的根本原因是什么呢? p53、p21 和gaddl53 等基因表达状况在紫外线照射前后的变化可能为我们提供了一些有价值的线索.
DNA 损伤后, 会通过一定的信号传导途径引起细胞反应, 诱导众多基因表达的激活或抑制,DNA 修复系统的激活则是细胞维持自身功能完整性和细胞生存的一个重要机制[ 9 ]. p 53 在DNA损伤监控中处于检验点控制的位置, 起着中枢作用,p21 及gadd153 均为其下游基因, 它们有着部分共同的途径, 又可通过各自不同的途径作用于细胞周期及修复系统, 在DNA 损伤修复基因调控网络中既互相协同又相互影响, 发挥着各自不同的作用[9]. p21是周期蛋白激酶的抑制因子,作为p 53的下游基因, 在p 53与细胞周期调控之间起桥梁作用. p 21的高表达会导致细胞周期阻滞, 还会通过与PCNA (增殖细胞核抗原) 相作用影响DNA 的复制及其修复[3]. gadd153 在紫外线的诱导表达中也是依赖于p53的, 它作为p53 的下游基因,一方面对损伤后的细胞周期有一定影响, 另一方面可能与DNA 损伤修复偶联. 有文献报道, gadd153对转录因子C/EBP (CAAT增强子结合蛋白) 家族有负调控作用[10]. 实验结果显示, 经紫外线损伤后无论年轻及衰老细胞出现的G1 期的阻滞同时伴随着gadd153、p 21、p 53 基因的高表达, 这说明这三种基因的可诱导与细胞周期阻滞有着直接的关系; 然而, 有趣的是衰老细胞在紫外线照射前即存在明显的G1 期阻滞, 此时仅见p 21 的高表达, 这说明p 21对衰老细胞G1 期的阻滞可能起主要作用, 而p21的高表达是因为衰老细胞中存在的损伤累积不能被有效修复所致. 因为衰老细胞本身即存在明显的G1期阻滞, 加之p 53、gadd153, 尤其是p 21 基因的诱导性下降, 可能是衰老细胞G1 期增幅低于年轻细胞的原因. 同时, 衰老细胞修复能力的下降也可能与gadd 基因(包括gadd153, gadd45 等)、p 21 及p 53 等基因的DNA 损伤后的可诱导性在衰老细胞中的下降有关. 实验结果显示, 衰老细胞中虽然p 21 这一细胞周期抑制因子的高表达导致了细胞的G1 期阻滞, 为修复损伤争取了时间, 但其它与修复直接相关的基因却不能有效地表达和发生作用. 实验中还发现, p 53 表达变化并不十分显著, 说明p 21 在衰老细胞中的高表达有可能通过非p 53 途径调控[ 10 ]; 但另一方面这可能与p 53 作用通过磷酸化状态的改变而实现有关[ 11 ] , 在损伤诱导后, p 53 蛋白与各种基因的结合活性可能通过其磷酸化状态的改变而有所改变, 这同样可能是衰老细胞中p 53 未见显著高表达的原因之一. 然而, 这几种基因在衰老细胞中的损伤可诱导性下降却具有一致性, 这可能正是衰老细胞在DNA 损伤后细胞周期调控能力及修复能力下降的根本原因之一. 总之, 探讨衰老细胞在DNA 损伤后细胞周期调控、DNA损伤修复以及DNA 损伤可诱导基因的表达改变, 有助于DNA 损伤修复基因调控网络的阐明, 对于揭示DNA 损伤修复与细胞衰老的关系具有重要的理论意义.
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