磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞

PriCells: 磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞

基本方案

用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4⁺细胞或CD8⁺T细胞的自动分离

实验材料

1、小鼠

2、HBSS洗涤缓冲液

3、MACS缓冲液

4、磁珠

5、RPMI-10完全培养基

6、AUTOMACS系统和分选柱

7、30μm尼龙网或40μm预分离滤膜

实验方法

1、用5只小鼠的淋巴结或2只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞。

2、细胞在10mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

3、细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清后将沉淀按每10⁸个细胞0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每10⁸个细胞加入0.1ml适当的磁珠后在4℃孵育15min。

4、在孵育的时间里，打开AUTOMACS系统电源。按产品说明书中操作规程运行清洁程序。

5、细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到10⁸个细胞/ml，充分混悬。将细胞通过30μm尼龙网或40μm预分离滤膜。用0.1～0.4mlMACS缓冲液冲洗滤网。

6、细胞放到AUTOMACS的上样通道。选择possel程序，这样标记的细胞将从阳性通道洗脱。

7、细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清后将沉淀用2～5ml RPMI-10完全培养基混悬。计数。

附录：

RPMI完全培养基：

       RPMI1640培养基含有:

       2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃热灭活1h

       2μmmol/L L-谷氨酰胺

       50μmol/ml 2-ME

       100U/ml 青霉素

       100μg/ml 硫酸链霉素

RPMI-10完全培养基：

       配制RPMI完全培养基加入:

       10%（V/V）FBS

       1mmol/L 丙酮酸钠

       50μg/ml庆大霉素

       10mmol/L HEPES

       4℃可保存2周

       过滤除菌

HBSS洗涤缓冲液：

       HBSS，含有：

       5%（V/V）FBS

       20mmol/L HEPES，pH7.0

       100U/ml 青霉素

       100μg/ml 链霉素

       4℃可保存1个月

MACS缓冲液：

       PBS，pH7.2

       0.5%（m/V）BSA

       2mmol/L EDTA

       过滤除菌

       用于自动MACS系统，室温储存1个月

       用于LS或LD柱时，脱气，4℃保存