因为理论计算的TM值用来确定退火的温度只是一个参考呀,最合适的退火温度会因为各种原因而有所差异,就连PCR仪都会有影响的,我们实验室就是,好多都是在一台能拉出条带,而在另一台上就拉不出条带,或者相反的。
降落（TD）PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法。由于开始时的退火温度选择高于估计的Tm值，随着循环的进行，退货温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平。此策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异性杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异性）PCR产物的地位。有人研究发现一些本来产生满意的单一扩增产物的反应采用TD PCR时变得更好进行了。
提醒一下，如果说明书上的Tm值和Oligo或者Primer上分析的差别挺大的，你要以软件上的计算为准。 我觉的你两个引物Tm值差的太多，不过你也可试。68度开始，每个循环下降0.5度，或者0.2度，最后62度来个20循环。
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