WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的，通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度要快。但是迁移率也是受到其他因素影响的，这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。主要有以下几种常见因素：
翻译后修饰－比如磷酸化、糖基化等，这些修饰会增加蛋白质的分子量
翻译后剪切－ 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式，如pro-caspases
不同剪切体 – 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
相对电荷（Relative charge） – 氨基酸的组成(charged vs non-charged)
多聚体－如二聚体或三聚体。这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件，因此造成检测的条带偏大。
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