流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群（二）

2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。

3 不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。

4 流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml
离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。最后以300µl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。

5 流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。

结果
 
1 不同浓度的PMA对人外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表达明显下降，已经不能区分出CD4阳性T淋巴细胞，而CD8和CD3的表达未受明显影响。重复5次检测，典型的检测结果见图1。


图1 10ng、20ng、50ng PMA和500ng/ml Ionomycin共同刺激4h后人外周血T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。

图中A、B、C系列分别是10ng、20ng、50ng PMA刺激后CD4、CD8和CD3的表达。各种浓度的PMA刺激后均不能有效的区分CD4阴性和CD4阳性细胞，而CD3和CD8的表达受影响很小，可以有效的区分阴性和阳性细胞。