实验材料 培养基中生长的适宜细胞株
试剂、试剂盒 乙腈考马斯亮蓝 R-250EBC 裂解缓冲液NETN磷酸盐缓冲溶液SDS 凝胶加样缓冲液三氟乙酸胰蛋白酶胰蛋白酶消化缓冲液沉淀靶蛋白的抗体对照抗体不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
仪器、耗材 沸水浴蛋白质 A-Sepharose平板摇台
实验步骤
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到适当浓度
乙腈（50%)
考马斯亮蓝 R-250
EBC 裂解缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
120 mmol/L NaCl
0.5%(V/V) Nonidet P-40
5ug/ml 白胃素
10ug/ml 抑肽酶
50ug/ml PMSF
0.2 mmol/L 正钒酸纳
100 mmol/L 氯化纳
NETN
20 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
100 mmol/L 氯化钠
0.5%Nonidet P-40
NETN, 含 900 mmol/LNaCl
磷酸盐缓冲溶液
1xSDS 凝胶加样缓冲液
三氟乙酸（TFA)(0.1%，m/V， 测序级）
酶及缓冲液
胰蛋白酶
在 200 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.9)(测序级，Boehringer Mannheim 公司）溶液中制备 250ug/ml 的牛胰蛋白酶
胰蛋白酶消化缓冲液
0.02%(V/V) 吐溫-20
200 mmol/L 碳酸氢铵（pH8.9)
抗体
沉淀靶蛋白的抗体
对照抗体
凝胶
不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
分离胶（pH8.8 的 7.5%~15% 不连续胶）应为 20~30 cm 长，浓缩胶（pH6.8 的 5% 胶）应为 10 cm 长，孔本身应为 1~2 cm 深（胶的百分浓度会随目的蛋白而有所不同）。倒浓缩胶时不用多孔梳子，通过在玻璃板间垂直插入垫片来制作加样孔，这样可以形成足够大的加样孔。关于 SDS-PAGE 的详情请见附录 8。
专用设备
沸水浴
蛋白质 A-Sepharose
在 NETN 缓冲液中制备 1:1 悬浮的蛋白质 A-Sepharose
平板摇台
附加试剂
此方案的步骤 10 和 11 需要肽谱分析、肽纯化和测序的试剂和仪器（请见 Spector et al.1998,62 和 63 章）
细胞和组织
培养基中生长的适宜细胞株
方法
重要：这一方案是用于确定 pVHL 结合蛋白。对目标蛋白应当进行条件优化。
1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞（总共约 6X107 个细胞)。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4°C 以最大速度离心 15 min。
3. 收集上清（约 30 ml) 并加入 30ug 的适当抗体，4°C 摇动免疫沉淀物 1h。
4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4°C 再摇动免疫沉淀物 30 min。
5. 用含 0.9 mmol/LNaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。
6. 吸出混合物的液体部分。加入 800ul 的 1XSDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min。
7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10mA 的恒定电流下电泳过夜。
8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带（附录 8)。
9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
a. 将胶条移到一个清洁的表面，让它不完全干。
b. 加 5ul 胰蛋白酶消化缓冲液和 2ul 胰蛋白酶溶液。
c. 在胶吸附胰蛋白酶溶液后，每次加 5ul 的胰蛋白酶缓冲液，直到胶条恢复到最初的大小。
d. 将胶条置于微量离心管中，浸泡在胰蛋白酶消化缓冲液中并在 30°C 孵育 4 h。加入 1.5ul 的 0.1% 三氟乙酸终止反应。
蛋白质的观察和消化步骤变化很大。事实上，蛋白质还在聚丙烯酰胺凝胶中时，或蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 胰上后，都可进行消化。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。
供序或 Edman 分析的样品处理也有变化，最好与操作仪器的人讨论。对方法的评述，请见 Matsudaira(1993)、Link(1999) 及 Spector 等（1998, 第 62 和 63 章）的文献。
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