21. 当单层细胞再次生长到大约 80% 汇合度，每个细胞克隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试蛋白的诱导表达。
以后使用冻存细胞的时候, 需要复苏，然后在含有 500umol/L L-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 但不含组氨酸的 DMEM 培养液中培养。
22. 如果细胞用 tTA 和靶质粒共转染，可以如阶段 3 所述直接分析靶基因的产物。如果细胞只用 pTet-tTAk 质粒转染，如下进行细胞的诱导表达测试：
a. 诱导前一天，细胞以适当的密度在含有 500umol/L L-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的 DMEM 培养液中培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。
b. 第二天，用 PBS 洗细胞 3 次，每次都要轻轻旋转培养板。
c. 第三次洗涤后，立即加入含有 500umol/LL-组氨醇但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养 6~48 h。
23. 通过 Northern 分析或免疫印迹法测试细胞中 tTA 的诱导表达。然后如阶段 2 所述，用靶质粒转染表达 tTA 的细胞系。
稳定转染的 NIH-3T3 细胞中，通常诱导 6 h 后可以观察到 tTA 和靶基因的表达，再过 6 h 后，表达量达到最大值。
阶段 2: 四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达 tTA 的 NIH-3T3 细胞
材料
缓冲液和溶液
小 牛 血 清（ 10%)
HEPES 缓冲液
磷酸缓冲液
酶和缓冲液
合适的限制性内切酶
1X 胰酶-EDTA
0.05% 胰酶
0.5 mmol/LEDTA(pH8.0)
培养液
含有 500umol/L-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液（含或不含 3ug/ml 嘌呤霉素）
不含组氰酸的 DMEM
100 单位/ml 靑霉素
100ug/ml 链霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
10% 小牛血清
500umol/LL-组氨醇（由 125 mmol/L 贮液稀释，在-20°C 贮存）
0.5ug/ml 四环素-HC1(溶于 70% 乙醇，浓度 10mg/ml, 贮存于-20°C。）
Irvine Scientific 公司（Santa Ana，Califomia）出售不含组氨酸的 DMEM。含有 0.5ug/ml 四环素-HCl的选择培养液在 4°C 可以避光保存大约 1 个月。
适当的时候加 3ug/ml 嘌呤霉素。
特殊设备
塑料克隆环
克隆环竖放在一薄层其空脂上离压灭菌
聚丙乙烯管（4 ml)
组织培养皿（6 cm 和 10 cm)
组织培养板（24 孔）
附加试剂
本阶段步骤 3 需要列在本方案阶段 1 中的试剂。
载体和菌株
pPGKPuro(或带有其他选择标记的载体）
所有质粒都用 CaCl-液化乙锭梯度平衡离心（第 1 章方案 10）或层析柱纯化（第 1 章方案 9)。
关于选择标记的信息，请见 Damke 等（1995)。质粒 pTet-Splice 和 PUHC13-3 在 Life Technologies 公司有售。其他带有选择标记的载体也有出售（如 Piomega 公司有 pCI-neo,CLONTECH 公司有 pTK-HVG 或 pPUR)。如果以其他载体代替 pPGKPuro, 就用适合该质粒所带选择标记的选择培养液。
带有报道基因的 pTet-Spliqe(可选，如 PUHC13-3)
带有靶基因开放阅读框的 pTet-Splice
细胞和组织
可诱导表达自调控 tTA 的稳定细胞系 （阶段 1)
方法
培养和转染细胞
1. 在含有 500umol/LL-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的完全选择培养液中培养可以诱导表达自身调控的 tTA 的稳定细胞系（阶段 1 中分离得到)。转染前一天，把细胞传代到含有完全选择培养液的 10 cm 组织培养皿中。每个培养皿转入足量细胞，使转染那天单层细胞可以有 33% 的汇合度。
重要：从这时起除非特别说明，细胞都在 37°C,5%CO2，含有 0.5ug/ml 四环素-HCl 的培养液中培养。
2. 在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每种质粒的浓度调整为≥0.5 mg/ml。每种粑基因质粒 10~20ug 和 1~2ug pPGKPuro(每种四环素质粒与带选择标记的质粒的摩尔比为 10:1) 与 500ul HEPES 缓冲液在一个干净的 4 ml 聚丙乙烯管中混合。
3. 进行阶段 1 中的步骤 3~13。
重要：阶段 1 中要求用含四环素的 DMEM 完全培养液的地方，在本转染中一定要换成含有 500umol/L L-组氨醇和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的选择培养液。
选择和克隆转染细胞
4. 转染后 48 h, 细胞用几种稀释度分到含有 500umol/L L-组氨醉、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液中。细胞密度为每个 10 cm 培养皿大约 1X106 到 3X104、含有大约 1X105 细胞的培养皿需要培养若干个。
可以在几天内杀死所有未转染细胞的嘌呤霉素的最低浓度需要在转染前依靠经验确定，而且随着细胞类型不同而有不同。3ug/ml 嘌呤霉素足以筛选转染的 NIH-3T3 细胞。嘌呤霉素在到的浓度范围内可以有效地杀死大多数类型细胞。
5. 细胞在选择培养液中培养 4 天后，接着用 3~4 ml 含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液培养。
6. 集落长好以后（选择培养 12~14 天），在培养皿的底部用圆画出每个集落的边界。吸掉培养液，在培养皿的单个克隆上放置无菌的塑料克隆环。每个挑选的集落重复这个步骤。从培养皿中挑选细胞，要求单个集落隔得比较开，而且易于分辨。
7. 用大约 100ul 磷酸缓冲液很快地洗克隆。为了使细胞脱落，加 2 滴 1X 胰酶-EDTA(~100ul) 并放置 30~60s。用巴斯德吸管上下吹打使细胞变松。每个集落转移到 24 孔组织培养板的一个孔中，每个孔中有1ml 含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和0.5ug/ml 四环素的选择培养液。
随后的细胞传代都用标准方法，如 (1)PBS 快速洗涤，(2)1~3 min 胰酶-EDTA 消化（每个铺满细胞的培养皿加 2 ml), 用 10% 小牛血清（3 ml) 稀释/终止胰酶的活性。
8. 当孔中的细胞长到 80% 汇合度，把它们转移到 6 cm 组织培养皿中，用含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液培养。
NIH-3T3 细胞可以在大约 4~7 天生长到 80% 汇合度；但是不同细胞系甚至不同克隆生长到 80% 汇合度所需的时间是不同的。
9. 细胞在含有 500umol/LL-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素的选择培养液中扩大培养（通常细胞进行 1:5 到 1:10 稀释)。
10. 当单层细胞再次生长到大约 80% 汇合度，每个细胞充隆收集一部分，在液氮中冻存。余下的细胞进行传代培养，直到数量足够用于测试靶基因蛋白的诱导表达。测试方法在阶段 3 介绍。
以后使用冻存细胞的时候，需要复苏，然后在含有 500umol/LL-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的选择培养液中培养。
阶段 3: 分析转染钿胞中的蛋白质表达
材料
缓冲液和溶液
贮存液稀释到适当浓度。
小牛血清（10%)
磷酸缓冲液
1X 蛋白样品缓冲液
抗体
适于用免疫印迹法测定感兴趣的靶蛋白的抗体
凝胶
Tris-甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
灌胶所用的丙烯酰胺浓度要适于靶蛋白的观察，见附录 8。
培养液
含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素的选择培养液（含或不含 0.5ug/ml 四环素）
不含组氨酸的 DMEM
100 单位/ml 育霉素
100ug/ml 链霉素
2 mmol/L 谷氨酰胺
10% 小牛血淸
500umol/L L-组氨醇（由 125 mmol/L 贮液稀释，在-20°C 贮存）
3ug/ml 嘌呤霉素
Irvine Scientific 公司（Santa Ana,California) 出售不含组氨酸的 DMEM。
适当的时候加四环素，使浓度为 0.5ug/ml(四环素-HCl 溶于 70% 乙醇，浓度 10 mg/ml，贮存于-20°C)。含 0.5ug/ml 四环素-HCl的选择培养液在 4°C 可以避光保存太约 1 个月。
特殊设备
沸腾的水浴锅
聚偏二氟乙烯（poiyvinylidene difluoride，PVDF）膜
附加试剂
本方案步骤 13 需要列在附录 8 中用于免疫印迹法的试剂和设备。
细胞和组织
可诱导表达自身调控的 tTA 并含有携带感兴趣靶基因的质粒的稳定细胞系
方法
细胞的生长和诱导
1. 诱导前一天晚上，细胞以适当的密度在含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素和 0.5ug/ml 四环素-HCl 的 DMEM 培养液中培养，使它们在收获时可以达到亚汇合态。
2. 第二天，用 PBS 洗细胞 3 次，每次都要轻轻旋转培养板。
3. 第三次洗涤后，立即加入含有 500umol/L L-组氨醇、3ug/ml 嘌呤霉素但不含四环素的选择培养液。细胞在含或不含四环素的培养液中培养 6~48 h。
在稳定转染的 NIH-3T3 细胞中，通常诱导 6 h 后有 tTA 和靶基因的表达，诱导大约 12 h 后表达达到峰值。
收获细胞
4. 细胞生长适当的时间后，快速收获并放到冰浴的管中。
如果用胰酶收获细胞，先用冷的不含钙和镁盐的磷酸缓冲液洗细胞，然后用冷的含有 10% 小牛血淸的选择培养液（根据需要，含或不含四环素）终止胰酶的作用。管子立即移到冰桶中。
5. 每个克隆和对照都转移 0.5X106 细胞到离心管中，然后所有管子在 4°C 以 3000r/min(低或中速）离心 5 min。
6. 加 1 ml 冰冷的磷酸盐缓冲液洗细胞。如步骤 5 洗细胞，轻轻吸掉上清，不要扰动细胞沉淀。
7. 细胞沉淀放在冰浴上，在离心管架上方的孔中轻快地旋动管于使沉淀变松，然后把它冻存在-70°C。
准备裂解物
8. 细胞沉淀用 30ul 蛋白样品缓冲液重悬，轻轻地吹打细胞，然后振荡管子。
这步也可能在冻细胞前进行。
9. 细胞在蛋白样品缓冲液中煮 10 min。
10. 以最大速度离心 2 min 收集细胞碎片。
11. 在 Tris-甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道加 10ul 细胞裂解物。
如果细胞裂解物不立即加到凝胶上，可以在-20°C 贮存，但是在上样前需要再次煮沸。
12. 用合适的时间跑胶（请见附录 8)。
13. 蛋白从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电转移到 PVDF 膜上，用合适的抗体检测（请见附录 8)。
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