实验方法原理 离心机和转头，沸腾的水浴锅， Dounce 匀浆器，晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管，聚丙烯管，刀片，预设到 30°C 的振荡水浴，预设到 4°C 和 65°C 的水浴
实验材料 非重组质粒载体含感兴趣 cDNA 或基因的重组质粒培养细胞或新鲜组织
试剂、试剂盒 氯仿DNA变性溶液乙醇甘油贮存缓冲液HSB缓冲液标记缓冲液LiCl裂解缓冲液NaClNaOHNonidet P-40细胞核洗涤缓冲液酚磷酸盐缓冲液预杂交液 杂交液反应缓冲液RNasinSDS终止缓冲液组织匀浆缓冲液台盼蓝染料DNA 酶溶液蛋白酶 K限制性酶放射性化合物
仪器、耗材 离心机和转头沸腾的水浴锅 Dounce 匀浆器晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管聚丙烯管刀片预设到 30°C 的振荡水浴预设到 4°C 和 65°C 的水浴
实验步骤
材料
重要：所有试管和溶液都必须不含RNA酶。
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录1。
贮存液稀释到适当浓度。
氯仿
氯仿：异戊醇
DNA变性溶液
2mol/L NaCl
0.lmol/L NaOH
乙醇
甘油贮存缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.3)
5 mmol/L MgCl2
0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)
40%(V/V)甘油
缓冲液贮存在 4°C
HSB缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH7.4)
50 mmol/L MgCl2
2 mmol/L CaCl2
0.5mol/L NaCl
缓冲液贮存在室温。
标记缓冲液
20 mmol/LTris-Cl(4°C 时 pH8.0)
140 mmol/L KCl
10 mmol/L MgCl2
1 mmol/L MoCl2
20%(V/V>甘油
14 mmol/L β-琉基乙醇
各 1 mmol/L ATP、GTP 和 CTP
10 mmol/L 磷酸肌氨酸
100ug/ml 磷酸肌氨酸激酶
0.1umol/L[32P]UTP，500~5000uCi/ml
最后 5 种组分在临用前加入，溶液保存在 4°C。放射性 UTP 加入后需要特规保护。
LiCl(5mol/L)
裂解缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(4°C 时 pH8.4)
1.5 mmol/L MgCl2
0.14mol/L NaCl
缓冲液贮存在4°C。
NaCl(2mol/L)
NaOH(0.1mol/L)
Nonidet P-40(5% V/V)
细胞核洗涤缓冲液
20 mmol/L Tris-Cl(4°C时pH8.0)
140 mmol/L KCl
10 mmol/L MgCl2
1 mmol/L MoCl2
20%(v/v) 甘油
14 mmol/Lβ-巯基乙醇
缓冲液贮存在 4°C。临用前，把β-琉基乙醇浓缩贮存液加到缓冲液中。
酚
磷酸盐缓冲液（PBS)
预杂交液/杂交液
核连缀实验中一般用含甲酰胺的杂交缓冲液，如 50%(V/V) 甲酰胺，6XSSC，5 mmol/L 焦磷酸钠，2XDenhardt 溶液，0.5%(m/V)SDS，10ug/ml poly(A)，100ug/ml 鲑鱼精 DNA。
2X 反应缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
5 mmol/L MgCl2
0.3 ml/L KCl
缓冲液贮存在 4°C。临用前在 1 ml 2x 反应缓冲液中加入 5ul 1mol/L DTT，100ul 100 mmol/L ATP，10ul 100 mmol/L CTP 和 10ul 100 mmol/L GTP。
RNasin
RNasin 是大鼠肝脏 RNA 酶抑制剂蛋白的通称。有些公司提供这种酶制品。
SDS(0.5%m/V)
6XSSC
终止缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)
20 mmol/L EDTA(pH8.0)
0.8%(m/V)SDS
缓冲液贮存在室温。
组织匀浆缓冲液
10 mmol/L HEPES-KOH(pH7.6)
25 mmol/L KCl
0.15 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 亚精胺
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
2mol/L 蔗糖
10%(V/V) 甘油
缓冲液贮存在 4°C。步骤 1 临用前，加入 CTT 使终浓度为 1 mmol/L，并加入蛋白酶抑制剂(0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟，1ug/ml 亮抑酶肽，1ug/ml 抑胃酶肽，或者加入其他所需试剂）。
台盼蓝染料（0.4%m/V)
取一定置染料溶于不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）中。室温贮存。
酶和缓冲液
DNA 酶溶液
在 1 ml 0.0025mol/L HCl 和 50%(V/V) 甘油中溶解 2 mg 不含 RNA 酶的 DNA 酶 (如 Worthington 公司)。溶液贮存在-20°C。
蛋白酶 K(可选）
限制性酶
请见步骤 9。
放射性化合物
[α-32P]UTP(500~5000uCi/ml)
每个核酸样品用 100uCi 进行放射标记。
离心机和转头
Beckman SW28 转头或类似产品
Sorvall H1000B 转头或类似产品
Sorvall SS-34 转头或类似产品
重要：所有转头预冷到 4°C
特殊设备
沸腾的水浴锅
带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器
晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管
聚丙烯管（17 mmx100 mm)
刀片
预设到 30°C 的振荡水浴
预设到 4°C 和 65°C 的水浴
辅助试剂
本方案步骤 11 需要列在第 7 章方案 9 中的试剂和设备。
本方案步骤 13 需要列在第 6 章方案 8 中的试剂。
本方案步骤 14~16 需要列在第 6 章方案 8 和 10 中的试剂。
载体和菌株
非重组质粒载体
含感兴趣 cDNA 或基因的重组质粒
细胞和组织
培养细胞或新鲜组织
方法
核酸分离和 RNA 转录物放射标记
1. 从培养的细胞或新鲜组织中分离核酸。
从培养的细胞中分离核酸
a. 从培养皿中刮下细胞，用冰冷的 PBS 洗两次。在聚丙烯管（17 mmXl00 mm) 中，用 1 ml 冰冷的裂解缓冲液重悬 1x107 到 1X108 细咆。加 2~4ul 5%NonidetP-40, 悬液冰浴 10 min。
b.10ul 悬液和等体积 0.4% 台盼蓝染料混合，在装有 20x 物镜的显微镜下检测溶液。裂解的细胞吸收染料显蓝色，未裂解的细胞由于染料不能透过而仍然透明。继续加入 2ul 5%NonidetP-40, 观察细胞裂解情况直至大于 80% 的细胞裂解。
c. 用台式离心机以 1300 g(Sorvall Hl000B 转头 2500r/min) 离心 1 min 回收核酸。去掉上清。核酸沉淀用 lml 核酸洗涤缓冲液洗两次。进行步骤 2。
从组织中分离梭酸
a. 解剖 10~15 g 组织并切碎。用冰冷的组织匀浆缓冲液调整切碎组织的体积到 30ml, 在紧型 Dounce 匀浆器中匀浆。
b. 为了检测裂解情况，10ul 细胞悬液和等体积 0.4% 台盼蓝染料混合，在装有 20X物镜的显微镜下检察溶液。裂解的细胞吸收染料显蓝色，未裂解的细胞由于染料不能透过而仍然透明。继续组织匀浆直至大于 80%~90% 的细胞破裂。
c. 用冰冷的组织匀浆缓冲液稀释匀浆物到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管中，10 ml 冰冷的匀浆缓冲液垫层上铺 27 ml 匀浆物。管子在 4°C 以 103900g(Beckman SW28 转头 24000r/min) 离心 40 min
d. 去掉上清，管子倒置 l~2 min。管子放到冰上。用 2 ml 甘油贮存缓冲液上下吹打重悬沉淀物。
(可选）用刀片切掉管子的上部 2/3, 在用甘油贮存缓冲液重悬沉淀物前，把装有核酸的 1/3 底部放在冰上。
e.10ul 核酸悬液与 990ul 0.5%SDS 混合。用紫外分光光度计测 OD260， 用甘油贮存缓冲液稀释核酸悬液，使终浓度为 50 OD260/ml。用 1.5 ml 离心管把核酸制备物分装成 200ul 的小份，液氮怏速冷冻，贮存在-70°C。进行步骤 2。
2. 在纯化的核酸中对新生 RNA 进行放射标记。
对于从培养的细胞中分离的核酸，放射标记其中的转录物
a. 最后一次洗涤后（步骤1c), 尽可能多地去掉上清，用 50~100ul 标记缓冲液重悬核酸。核酸在 30°C 振荡水浴中孵育 15~20 min。
警吿：放射性 UTP 加到溶液中以后，要极其小心戴手套和眼镜并且注意不要用高放射性溶液等污染台面。
b. 在台式离心机中以 800 g（Sorvall H1000B 转头 1960r/min) 离心 5 min 沉淀核酸，小心去掉上清，以放射性废料处理。进行步骤 3。
如附录 8 所述，可以用三氯乙酸（TCA) 沉淀法检测 [32P]UTP 掺入 RNA 的情况。对于一次成功的标记反应，如果含有放射标记的 UTP 和 10OD260 核酸，那么 80%~90％32P 会掺入到可用 TCA 沉淀的物质中。
对于从组织中分离的核酸，放射标记其中的转录物
a. 把适世的细胞核制备物从-70°C 转移到冰桶中。液体溶解后，每管加 400 单位 RNasin。每管核酸中加 200ul 补充有核苷酸和 DTT 的 2X 反应缓冲液。加入 100 uCi[α-32P]UTP。
警告：放射性 UTP 加到溶液中以后，要极其小心。戴手套和眼镜并且注意不要用高放射性溶液等污染台面。
b. 核酸在 30°C 振荡水浴中孵育 20 min。2000r/min 离心 1~2 min 回收核酸。小心去掉上清，以放射性废料处理。进行步骤 3。
如附录 8 所述，可以用三氯乙酸（TCA) 沉淀法检测 [32P]UTP 掺入 RNA 的情况。对于一次成功的标记反应，如果有100uCi 放射标记的 UTP 和 10OD260 核酸，那么 80%~90％32P 会掺入到可用 TCA 沉淀的物质中。
3. 用1ml 冰冷的 HSB 缓冲液重悬细胞核沉淀物，然后加入 10ul DNA 酶溶液。上下吹打核酸直到核酸重悬起来并且溶液的黏滞度下降（1~5 min)。加 2 ml 终止缓冲液。
DNA 酶处理可以减低溶液的黏滞度并防止新生的放射标记 RNA 转录物被基因组 DNA 捕获。黏滞度不会完全消除，也经常会留有核酸团块。
4.(可选）为了提高放射标记 RNA 的产量，在 DNA 酶处理以后，可以加入蛋白酶 K。在加入 2 ml 终止缓冲液后，加入蛋白酶 K 使其终浓度为100ug/ml。溶液在 42°C 孵育 30 min。进行步骤 5。
更大规模的 DNA 去除和放射标记 RNA 纯化的方案请参见 Groudine 等 (1981)。
5. 加 3 ml 酚，混合物在 65°C 孵育 15 min, 在此期间每 5 min 进行振摇。加 3 ml 氯仿/异戊醇，振荡，以 1900 g 离心分离有机相和水相（Sorvall Hl000B 转头 3000r/min)。
再次用 3 ml 氯仿抽提水相，如前离心，并把水相转移到新管中。
6. 加 0.3 ml5mol/L LiCl 和 2.5 倍体积的乙醇，混合均勻。以 12000 g (Sorvall SS-34 转头 10000r/min) 离心 10 min 收集核酸沉淀。
7. 用 0.4 mlH2O 重悬沉淀物并转移到 1.5 ml 离心管中。加 40ul 5mol/L LiCl 和 2.5 倍体积的乙醇。溶液以最高速离心 10 min。
8. 用 100ul H20 重悬沉淀物，在液闪计数器中测量 cpm/ul。
RNA 与固定的 DNA 杂交
9.10ug 含感兴趣 cDNA 或基因的重组质粒 DNA 以及 10ug 空质粒载体用限制性酶线性化，使用的限制性酶切割位点必须在载体序列中存在。
10. 切割后的 DNA 用标准的乙醇沉淀法回收，分别用 20ulDNA 变性溶液重悬沉淀物。DNA 重悬液煮 2 min, 然后每管加入 180ul 6XSSC。
11. 切一片尼龙膜或硝酸纤维素膜，大小适用于点杂交或狭缝杂交的器具。腆用水浸湿, 然后在 6XSSC 中授泡 5~10 min。湿膜夹到杂交器具上，连上真空管并接上抽气泵（请参见第 7 章方案 9)。
12. 变性 DNA 分别从各个隔开的狭缝滤过，用 200ul 6xSSC 洗每个狭缝。
13. 拆掉杂交器具, 使膜风干，然后通过烘烤或紫外线曝光使 DNA 固定在膜上。
14. 膜放在预杂交液中，至少在合适的溫度孵育 16 h(例如，含 50% 甲酰胺的溶剂用 42°C）。
15. 放射标记探针（32P 标记的 RNA 取自步骤 8.2x106~4X106cpm/ml) 直接加到预杂交液中，滤膜再解育 72 h。
16. 用髙严谨性条件洗膜，对 X 射线胶片或磷屏板曝光。通常曝光时间对于 X 射线胶片是 24~72 h, 对于磷屏板是 4~24 h。
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