cDNA文库构建

实验方法原理

cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价

实验材料 mRNA

试剂、试剂盒 DTT蒸馏水dNTPEDTASDS乙醇聚合酶琼脂糖DNA聚合酶BSAT4 DNA连接酶酚氯仿异戊醇PCR纯化试剂盒

仪器、耗材 制冰机离心机水浴锅电泳仪离心管移液枪培养箱

实验步骤

一、Superscipt II—RT合成第一链

1.  在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water