7. 尽可能快地进行 cDNA 合成的下一步骤
阶段 2:cDNA 第二链的合成
材料
缓冲液和溶液
将贮存液稀释到合适浓度。
氯仿
EDTA(0.5mol/LpH8.0)
乙醇
MgCl2(1mol/L)
(NH4)2SO4(1mol/L)
将 1.3 g 固体硫酸铵溶解于终体积为 10 ml 的水中，溶液经滤膜过滤除菌后，贮存于室溫。
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD)(50 mmol/L)
将 33.2 mg β-NAD 溶解于 1 ml 水中，制成 50 mml/L 的贮存液，分装后贮存于-70°C。β-NAD 除可作为电子受体外，也是大肠杆菌 DNA 连接酶的辅因子。不要将其与α-NAD 混为一谈。
酚：氲仿（1:1，V/V)
RNase H 缓冲液（选用）
20 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)
20 mmol/L KCl
0.1 mmol/L EDTACpH8.0)
0.1 mmol/L DTT
只有进行步骤 1 的备选步骤时，方需使用此缓冲液，
乙酸钠（3mol/L,pH5.2)
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液
TE(PH7.6)
Tris-HCl(2mol/L,pH7.4)
酶和缓冲液
T4 噬菌体 DNA 聚合酶（2.5 单位/ul)
T4 噬茵体多核苷酸激酶（30 单位/ul)
大肠杆菌 DNA 连接酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I
RNase H
有数家厂商出售来自大肠杆菌的 RNase H 纯品，其比活需达到约 1000 单位/ml。
核酸和寡核苷酸
dNTP 溶液（含有 4 种 dNTP, 每种浓度为 10 mmol/L)
cDNA 第一链
使用按本方案步骤 1 制备的第一链大规模反应混合物。
参照物
见本方案末疑难解答"cDNA 第二链合成的优化"。
放射性化合物
[a-32P]dCTP(10mCi/ml,400Ci/mmol)
不要用 [a-32P]dTTP 作为监视 cDNA 第二链合成的放射性示踪剂。因为它们可能偏爱掺入到对应于 mRNA3'端 poly(A)+尾巴的第二链部位。
在开始本方案前，才能融化 [a-32P]dCTP, 将融化的放射性标记的 dCTP 存放在冰上直到步骤 1 需用时。使用后必须立即将放射性标记的 dCTP 放在冷冻室内。
专用设备
SephadexG-50 离心柱
将知 Sephadex G-50(中等大小孔径）加到无菌水中（10 g 干粉产生 160 ml 悬浆）。用无菌水清洗膨胀的树脂数次以除去可溶的葡聚糖，否则在乙醇沉淀时由于沉淀可造成问题。最后用含有 10 mmol/L NaCl 的 TE(pH7.6) 溶液平衡树脂，高消毒 [10 psi(0.70 kg/cm3)15 min] 并储存于室温。预装好的 Sephadex 柱和其他凝胶过滤树脂有商品销售。
预设温度为 16°C 的水浴
方法
用 RNaseH 和 DNA 聚合酶 I 催化合成 cDNA 第二链会导致 mRNA 模板 5'端序列的缺失（约 20 个核苷酸)。这是因为在 DNA 聚合酶 I 起始合成第二链前，RNaseH 降解了 mRNA-DNA 杂合体的 5'序列（D'Alessio and Gerard 1988)。大多数真核 mRNA 的 5'端含有一大段非翻译序列，因此缺失相当于 5'端 20 个核苷酸的 cDNA 克隆对大多数研究者将不会产生有害结果。另外，对于那些对 5'端序列非常关心的研究者，我们提供了一种步骤 1 的备选方法，可减少 cDNA 克隆失去 5'端的危险。不幸的是，这种方法可导致双链 cDNA 产量降低，所以大多数研究者愿意选择步骤 1 的标准方法。
1. 将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中（阶段 1, 步骤 4):
10 mmol/L MgCl2 70ul
2mol/LTris-HCl(pH7.4) 5ul
10mCi/ml[a-32P]dCTP(400Ci/mmol) 10ul
1mol/L(NH4)2SO4 1.5ul
RNase H(1000 单位/ml) 1ul
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(10000 单位/ml) 4.5ul
温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机内稍离心，以除去所有气泡。在 16°C 温育 2~4 h。
2. 温育结束，将下列试剂加到反应混合物中；
β-NAD(50 mmol/L) 1ul
大扬杆菌 DNA 连接酶 (1000~4000 单位/ml) 1ul
室温温育 15 min。
3. 温育结束，加入 1ul 含有 4 种 dNTP 的混合物（每种浓度为 10 mmol/L）和 2ul(5 单位）T4 噬菌体 DNA 聚合酶。反应混合物室温温育 15 min。
4. 取出 3ul 反应物。按步骤 7 和步骤 8 描述的方法测定第二链 DNA 的质量。
5. 将 5ul0.5mol/L EDTA(pH8.0) 加入剩余的反应物中，用酚: 氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在 0.3mol/L(pH5.2) 乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收 DNA, 将 DNA 溶解在 90ul TE(pH7.6) 溶液中。
6. 将下述试剂加到 DNA 溶液中：
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 10ul
T4 多核苷酸激酶（3000 单位/ml) 1ul
室温温育 15 min。
7. 测定从上面步骤 4 取出的 3ul 反应物中放射性活度，并按附录 8 所述方法测定 1ul 第二链合成反应产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8. 用下面公式计算第二链反应中所合成的 cDNA 量。要考虑到已掺入到 DNA 第一链中的 dNTP 的量。
这里 x 表示 cDNA 第一链量（来自阶段 1 步骤 6)。DNA 第二链合成量通常为第一链量的 70%~80%。
9. 用等量酚: 氯仿对含有磷酸化 cDNA(来自步骤 6) 的反应物进行抽提。
10.Sephadex G-50 用含有 10mmol/LNaCl 的 TE(pH7.6) 溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的 dNTP 和 cDNA 分开（见附录 8)。
11. 加入 0.1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠（pH5.2) 和 2 倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的 cDNA, 将样品置于冰上至少 15 min, 然后在微量离心机中以最大速度 4°C 离心 15 min, 回收沉淀 DNA。用手提微型监测仪检査，是否所有放射性都沉淀下来。
12. 用 70% 乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13. 小心吸出所有液体（检查吸出的液体中是否完全没有放射活性)，空气干燥沉淀物。
14. 如果霈要用 EcoRI 甲基化酶对 cDNA 进行甲基化，可将 cDNA 溶解于 80ul TE(pH7.6) 溶液中（见本方案步骤 3)。另外，如果要将 cDNA 直接与 Not I 或 Sal I 接头或寡核苷酸衔接子相连（见本方案步骤 4), 可将 cDNA 悬浮在 29ulTE(pH7.6) 溶液。
沉淀的 DNA 重新溶解后，尽快进行 cDNA 合成的下一步骤。
在 cDNA 文库构建过程中，需多次采用乙醇沉淀 cDNA。因为 cDNA 量常常非常少（经常非常珍贵)，所以必须特别小心，以求 cDNA 回收比例达到最大。有关这方面建议，见附录 8。
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