实验材料 带 mutS 表型（例如BMH71-18) 的转化用大肠杆菌感受态带 mut+表型的转化用大肠杆菌感受态

试剂、试剂盒 退火缓冲液贮存液合成缓冲液噬菌体 T4DNA 连接酶噬菌体 T4DNA 聚合酶或测序酶单一位点的限制性内切核酸酶琼脂糖凝胶诱变引物选择引物质粒 DNA

仪器、耗材 70°C 水浴和适合限制酶消化反应溫度的水浴LB 琼脂平板和含合适抗生素的 LB 液体培养基

实验步骤

材料

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。

将贮存液稀释到合适的浓度。

10x 退火缓冲液

200 mmol/LTris-Cl(pH7.5)

100 mmol/LMgCl2

500 mmol/LNaCl

10X 合成缓冲液

100 mmol/L Tris-Cl (pH7-5)

dTTP、dATP、dCTP、dGTP 每种浓度为 5 mmol/L

10 mmol/LATP

20 mmol/LDTT

酶和缓冲液

噬菌体 T4DNA 连接酶

噬菌体 T4DNA 聚合酶或测序酶

噬菌体 T4 编码的天然 DNA 聚合酶不能从模板 DNA 上置换寡核苷酸引物 (Nossal 1974.Kunkel 1985,Bebenek and Kunkel 1989,Schens 1989)。

单一位点的限制性内切核酸酶

凝胶

1% 的琼脂糖凝胶（含 0.5ug/ml 溴化乙锭）

核酸和寡核苷酸

诱变引物

选择引物

诱变引物和选择引物一定要能退火成靶 DNA 的同一链，每条引物的 5'端一定要磷酸化。诱变引物设计见信息栏中有关诱变寡核苷酸专題。突变应位于引物的中间，突变位点两侧带有 10~15 个能与模板DNA 完全配对的碱基。寡核苷酸引物在使用前用高压液相色谱（HPLC) 或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 纯化（请见第 10 章，方案 1 或 5)。几个公司（Clomech;Pharmacia) 销售选择引物，某些公司（例如 Pharmacia) 也销售成对的"toggle」引物，它们可用于限制位点正向或反向转变，容许有序的多轮突变. 而不需亚克隆模板。

质粒 DNA

可通过商业销售的树脂进行柱层析或碱裂解法进行闭和环状质粒 DNA 的纯化（请见第 1 章，方案 2 或 9)。

培养基

LB 琼脂平板和含合适抗生素的 LB 液体培养基

专用设备

70°C 水浴和适合限制酶消化反应溫度的水浴

其他试剂

本方案步骤 7 和 14 需要的试剂列在第 1 章方案 23、24 或 26 中，大肠杆菌转化见方案 26。

本方案步骤 10 和 16 中少量制备质粒 DNA 需要的试剂列在第 1 章方案 1 中。

本方案步骤 17 所需的试剂列在第 12 章方案 3、4、5 中。

载体和菌株

请见附录 3

带 mutS 表型（例如，BMH71-18) 的转化用大肠杆菌感受态

带 mut+表型的转化用大肠杆菌感受态

请见步骤 14。

方法

突变 DNA 链的合成

1. 在微量离心管中混合以下物质:

10x 退火缓冲液                                     2ul

质粒 DNA                                              0.025 至 0.25pmole

选择引物                                               25pmoles

突变引物                                               25pmoles

加水至 20ul

沸水中孵育 5 min。

质粒 DNA 用量取决于反应中使用的引物和质粒 DNA。

2. 将离心管立即置于冰上冷却 5 min。微型离心机上离心 5s，使液体集中到离心管底部。

3. 将以下成分加入到含退火引物和质粒 DNA 的离心管中：

10X 合成缓冲液                                               3ul

噬菌体 T4DNA 聚合酶 （2~4 单位/ul)             1ul

噬菌体 T4DNA 连接酶（4~6 单位/ul)              1ul

水                                                                    5ul

用移液器温和的上下吹打几次将试剂混匀。在微型离心机上离心 5S, 使液体集中到离心管底部。37°C 孵育反应 1~2 h。

4.70°C 加热离心管至少 5 min, 灭活酶并终止反应。将离心管放置在实验台上冷却至室溫。

通过限制性内切核酸酶消化进行初筛

5. 将 NaCl 的浓度调节到适合单一位点限制酶反应的浓度。使用 10X 退火缓冲液,NaCl 贮存液，或限制酶提供的 10x 缓冲液。

在总体积为 30ul 的合成或连接混合物中，NaCl 浓度为 37.5 mmol/L。如果限制消化反应不需要 NaCl 或需要低于上述浓度的 NaCl, 可用乙醇沉淀合成连接缓冲液中的 DNA 混合物，或将 DNA 混合物通过一个悬浮在合适限制酶缓冲液中的离心柱。

6. 将 20 单位选用的限制性内切核酸酶加入到反应混合物中。在合适的溫度下消化至少 1 h。

重要：反应中的酶体积（包括聚合酶和连接酶）不应超过总反应体积的 10%。应按照以上比例相应地调节反应体积。

突变质粒的第 1 轮转化与富集

7. 按照第 1 章方案 23~26 所述的转化程序，用消化混合物中包含的质粒 DNA 转化如 BMH71-18 的 mutS 大肠杆菌菌株。

8. 用 10,50 和 250ul 转化混合物涂布含适当抗生素的 LB 琼脂平板上。37°C 孵育培养皿过夜。在培养皿孵育期间进行步骤 9。

这些培养皿被用于测定转化子的数量。每 50ul 转化混合物涂布的培养皿应产生 100~300 个克隆。

9. 加入 3 ml 含适当抗生素的 LB 培养液至剩余的转化混合物中以扩增质粒。37°C 振荡培养过夜。

10. 第二天从大约 2.5 ml 的过夜培养物中制备质粒 DNA(请见第 1 章方案 1)。

11. 用选择的限制酶消化步骤 10 制备的质粒 DNA。

质粒 DNA                                     500ng

10x 限制酶缓冲液                         2ul

单-位点的限制性内切酶                20ul

加水                                              至 20ul

在适当温度中孵育反应 2 h。

12. 再加入 10 单位的限制酶，孵育至少 1h。

13. 取 5~10ul 质粒 DNA 经 1% 的琼脂糖凝胶（含 0.5ug/ml 溴化乙锭）电泳，通过凝胶电泳评估消化结果。

未被消化的（环状的）DNA 经凝胶电泳分离成两条带，它们分别对应于松弛形的环状形式或超螺旋形式 DNA。线性化的质粒 DNA 呈现与环状 DNA 不同的条带。然而，由于亲本质粒占总质粒 DNA 的绝大多数，对应于未被消化的突变体质粒 DNA 的带与被消化的亲本质粒 DNA 带相比可能相当微弱。

最后一轮转化

14. 取 2~4ul 消化的质粒 DNA(大约 50~100ng), 转化化学方法处理的大肠杆菌 mutS+菌株，或用灭菌水对 1ul 质粒 DNA 进行 5 倍稀释（约 5ng)，电击法转化大肠杆菌 mutS+菌株（请见第 1 章方案 23~26)。

15. 分别取 10、50 和 250ul 转化混合物涂布含适当抗生素的 LB 琼脂平皿。37°C 孵育培养皿过夜。

16. 第 2 天，至少挑取 12 个单独的转化子进行小量质粒 DNA 制备，用限制性内切核酸酶消化，琼脂糖凝胶电泳，鉴定对抗选择性限制性内切核酸酶消化的质粒。

17.DNA 序列分析确定含预定突变的质粒（请见第 12 章方案 3、4、5)。