实验材料 适用于杯状 DNA 的 S30 提取物 适用于线状 DNA 的 S30 提取物 适用于环状 DNA 的 T7S30 提取物

试剂、试剂盒 无核酸酶的水 [35S] 标记的甲硫氨酸 1 mmol L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物 缺少氨基酸的 S30 反应混合液

仪器、耗材 —70℃ 冰箱 微量移液器 离心机 冰浴

实验步骤

―、材料与设备

1) 无核酸酶的水。

2)[35S] 标记的甲硫氨酸（1.25×10-5mol/L12000Ci/mmol)

3）1 mmol/L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物

4) 缺少氨基酸的 S30 反应混合液（Promega 公司）

5) 适用于杯状 DNA 的 S30 提取物（Promega 公司）

6) 适用于线状 DNA 的 S30 提取物 (Promega 公司）

7) 适用于环状 DNA 的 T7S30 提取物 (Promega 公司）

8)—70℃ 冰箱

9) 微量移液器

10) 离心机

11) 冰浴

二、操作方法

(一）适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统

2）轻轻涡旋，然后离心 5s, 以使反应混合物沉入管底。

3)37℃ 孵育 1〜2 h。

4) 将反应管置于冰浴上 5 min, 以终止反应。

5) 分析试验结果。利用三氯乙酸（TCA) 免疫沉淀实验和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以分析产物，

(二）适用于对线状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统

具体操作步骤同「(一）适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统」中的 1)〜5)。反应体系如表 4.2 所示

(三) 适用于对环状 DNA 迸行体外翻译的大肠杆菌 T7S30 提取物系统

具体操作步骤同「一）适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统」中的 1)〜5)，反应体系如表 4.3 所示；

注意事项

1)DNA 用量的优化。逋常，一个反应体系屮不应包含超过 4ug 的 DNA。因为随 DNA 的不断增加将会导致较多的未掺入标记氨基酸的目的蛋白的产生、从序列内部起始翻译反应的增加以及过¥结朵翻译的产物的不断增加。

2) 因为 S 标记的氨基酸极易被鉍化成亚砜类而失去活性，故应将 [35S] 标记的甲硫氨酸分装后保存于一 70℃, 每次融化后使用，以取得最好的反应结果。

3) 模板 DNA 和水的纯度是非常重要的。如果翻译效率低下，则应检查水与模板的纯度。

4) 反应可在 24〜37℃ 的温度范闱内进行，37°C 时反应速度最快，需时约 2 h。较低的温度会导致较低的催化速率，且反应时间会相应延长数小时。假如在 37°C 反应 lh 没冇产牛预期的结果，则应尝试在低温反应较长的时间，这样有利于增加蛋白的表达量和蛋白表达的特异性。