从革兰氏阴性菌中快速分离RNA

试剂、试剂盒 10 ml 革兰氏阴性菌培养液 原生质体缓冲液 50 mg ml 溶菌酶 革兰氏阴性菌裂解缓冲液 饱和 NaCl 溶液 DEPC 处理水 乙醇

实验步骤

一 材料与设备

1)10 ml 革兰氏阴性菌培养液，

2) 原生质体缓冲液：15 mmol/LTris-Cl(pH8.0)，0.45mol/L 蔗糖，8mmol/LEDTA.

3)50 mg/ml 溶菌酶。

4) 革兰氏阴性菌裂解缓冲液:10mmol/LTris-Cl(pH8.0)，10 mmol/LNaCl，lmmol/L 柠檬酸钠，1.5%(m/V)SDS

5) 饱和 NaCl 溶液，

6)DEPC 处理水

7) 乙醇

二 操作方法

1) 于 4℃ 12000g 离心从而从 10 ml 革兰氏阴性菌培养液中回收菌体，重悬于 10 ml 原生质体缓冲液，加入 50 mg/ml 溶菌酶，冰浴 15 min

2) 室温或 4℃ 离心回收原生质体。重悬于 0.5 ml 革兰氏阴性菌裂解缓冲液，加入 DEPC 水，混匀。移至微量离心管中，37°C 温育 5 min，在冰浴巾冷却。

3) 加入 250ul 饱和 NaCl，混匀，冰浴 10mim。

4) 于用微量离心机高速离心 15 min, 将上清移至两个干净微量离心管中，各加入lml 无水乙醇，在干冰中沉淀 30 min 或-20°C 过夜

5) 于 4℃ 用微量离心机高速离心 l5 min，用 500ul 冰冷 70% 乙醇冲洗沉淀，晾干。用 100ulDEPC 处理水溶解，取 10ul 稀释于 lml 水中，测 A260 和 A280 以定量 RNA. 保存于-70℃