于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解实验

实验方法原理

去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌，如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象，并对还原环境敏感，那么在裂解缓冲液中应除去二硫苏糖醇，并建议使用非还原/无脲的凝胶

实验材料 悬浮或单层的细胞培养物、细菌或酵母细胞

试剂、试剂盒 二硫苏糖醇（DTT)1×Laemmli样品缓冲液

仪器、耗材 离心机水浴锅

实验步骤

① 将1X107〜5X107个细胞加到1ml含有100mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。

②由于DNA的释放，在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏，克服黏性问题有2种方法：

a．离心裂解液100000g，20min，除去DNA;

b.超声破碎裂解细胞，每次超声15〜30s，共4次，每次之间将样品在冰上放置15s。

③在95℃水浴加热样品5min。

④20000g离心5min.

⑤转移上清到一个新管中。

⑥样品（上清）现在可以用于电泳和免疫印迹。在免疫印迹研究中，制备培养细胞提取物时，蛋白样品必须满足以下条件：

a.溶于适合凝胶电泳系统的溶液中（如，溶液的pH值应该在7.0左右，并且盐浓度为200 mmol/L左右）；

b.蛋白浓度不能超过特定凝胶系统的承载能力。对于传统凝胶，小胶的每个泳道的上样量不能>150μg的总蛋白

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注意事项

1×Laemmli样品缓冲液：

2%SDS

10%甘油

60mmol/L Tris-Cl(pH3.8)

0.01%溴酚蓝

通常把Laemmli样品缓冲液制成2X或5X的储液比较方便。在使用前，加DTT至终浓度100mmol/L。