蛋白质浓缩和溶质的去除实验（一）

一、层析

在过去的 2 0 年中，蛋白质组学技术的日益广泛应用，使蛋白质浓缩和脱盐的层析技术得到不断革新。蛋白质组学通常需要从少量复杂的混合物中富集蛋白质，包括选择性地浓缩特定种类的蛋白质。由于质谱 (M S ) 和基于抗体检测技术的高灵敏度及可提供详细生化特征的性质，它们在临床诊断、生物药物鉴定以及蛋白质结构与功能的基础性研究等广泛的应用中具有很高的实用性。这些应用需要分析生物体液中含量很低的药物靶标
和生物标志物, 或采集表达于异源系统的蛋白质的结构及翻译后修饰的详细信息。用于蛋白质组学分析的样品通常来自于水溶液, 其中可能包含一系列不挥发的盐类、溶剂、染料 、去污剂、离液剂、D N A / R N A 和脂类。这些污染物会降低高灵敏度分析技术的性能，尤其是对于电喷雾电离 (E S I) 基质辅助激光解吸/电离 (M A L D I ) 质谱 ，它们通过干扰样品电离、形成加合物以及形成离子源污垢等对分辨率和灵敏度造成有害的影响。因 此 ，很多供应商已经开发出众多用于目标蛋白质浓缩，并将它们从污染分子中进行高产率纯化的微型固相萃取程序和设备。

1 凝 胶 过 滤

凝胶过滤基质已经被广泛应用于在非变性情况下蛋白质的脱盐。与小分子物质不同，大分子蛋白质不会进入这些树脂的小孔中，从而在流动过程中将盐分除去。通常情况下 ，填料体积是样品体积的 4〜2 0 倍, 同时柱长与柱径的比值在 5〜1 0 时, 层析柱的分辨率最佳。在脱盐的过程中样品最少被稀释 1. 2 5 倍 ，但是，如果选择合适的洗脱剂，即使样品浓度在 ug/m L 的范围内，其损失也可以说是微乎其微。由不同商家提供的基于多聚糖
的葡聚糖凝胶介质已经被广泛应用于脱盐，成 系 列 的 Bio-Gel P 丙烯酰胺基质 (Bio-R a d ，Hercules, CA) ，允许用户根据目标蛋白质的分子质量定制介质的凝胶排阻极限。 ZebaSpin column (Thermo/Pierce， Rockford, IL) 提供了更多的方便，它能够通过离心作用对分子质量大于 7000 D a 的蛋白质样品进行快速脱盐而不需要柱平衡和重力流分级分离 。通过选择适当的柱子尺寸，可以对体积为 2〜4000ul的浓度低至25ug/m L 的蛋白质样品提供较高的回收率，同时对分子质量小于 1000 D a 的 分 子 具 有 高 达 95% 的 保 留 度 。 Zeba Spin m a t r i x 也可 以 以 9 6 孔板的形式使用，以方便同时对多个蛋白质样品进行高通量的非变性脱盐。

2 离 子 交 换 层 析

凝胶过滤蛋白质脱盐的一种替代方法是使用混合床离子交换 (IE X ) 树 脂 。大尺寸颗粒和表面修饰的混合床 IE X 吸着剂可以有效地捕捉小分子阴离子和阳离子(＜1000 Da),最小限度的截留高分子质量的蛋白质分子。脱盐可以通过分批处理模式来实现，或通过一个基质填料床来实现。然而 ，这种技术一个不良的后果是: 在常规 IEX 吸附剂的混合床发生的离子交换可引起蛋白质样品的酸化和沉淀。相比之下，用于牛奶和乳清脱盐的
离子滞留基质，通过吸收而不是离子交换来进行盐的摄取，因此，它可以在不发生显著p H 变化的情况下完成蛋白质的脱盐。可在市场上买到如 A G ll A 8 树脂 (Bio-R a d , H e r ­cules， CA) 。 类似于凝胶过滤，这些技术的缺点是在脱盐过程中发生蛋白质样品的稀释，因此可能在后续处理时需要对蛋白质进行浓缩。

3 反 相 层 析

反相 (R P ) 层析是分离、脱盐和浓缩蛋白质的一项很流行的技术, 一定程度上是由于样品被浓缩在小体积的可通过蒸发而去除的挥发性溶剂中。伴随着常规分析方法—质谱 (M S) 的到来，各种各样的反相提取形式被商业化，以提高质谱技术操作过程的速度和便利度。这些形式包括微型离心柱、毛细管、微量加样器吸头和微孔板，用于对样品量低至飞摩尔(femtomole) 级的蛋白质进行快速脱盐，并洗脱在微升级体积之中。通常情况下 ，在 p H < 4 和有离子配对剂（如 〇.1 % 〜I.0 % T F A )存在的情况下可使蛋白质和纯化柱中的胶实现最佳结合。有机组分的存在可能会促进蛋白质与纯化柱中的胶可逆结合，一般 为 15 % 的乙腈或甲醇，或离液剂（如盐酸胍)等。如果含有去污剂类污染物，则可能需要对样品稀释以防止其干扰蛋白质与吸附剂的结合。脱盐操作需要对树脂进行清洗, 如使 用 5 % 的甲醇、1% 的 T F A 等; 通过用可替代的离子配对剂进行实验可能会达到有选择的洗脱。要根据蛋白质的大小对反相吸附剂进行选择, 通常使用脂肪族的 C 4 、C 8、C 1 2 和C 18化合物。基于微量移液器的产品的一个例子是ZipTips (Millipore， Billerica, M A )，它用反相树脂颗粒或N u T i p s (G l y g e n , C o l u m b i a, M D )填充, 吸头的内壁用结合材料包被 ，因此减轻了反压力, 将样品与吸头表面的非特异相互作用减少到最小。为了同时对多个样品进行高通量脱盐, 也可以将反相树脂置于 9 6 孔板中，其中一个例子就是 ZipPlate模式 (Millipore， Billerica， M A )。

4 疏 水 和 亲 和 层 析

除了常用的凝胶过滤、离子交换和反相吸附剂，可用的其他材料, 如分批的或置于微型设备中的树脂可以支持多种模式的层析, 用于蛋白质的浓缩和脱盐。这些包括疏水、亲水 、金属螯合、蛋白质亲和树脂。值得注意的是，当蛋白质样品悬浮于一种有机溶剂并且需要去除污染的盐分或去污剂的时候，亲水介质为反相层析提供了一个有用的替代品。例 如 ，PAGE-P r e p 介质（T h e r m o /Pierce， Roc k f o r d, I L)，当蛋白质在5 0 % 二甲基亚讽存在的情况下与树脂结合时，它 可 用 于 SDS-PAGE 分析前蛋白质的脱盐。另 外 ，Glygen(Columbia， MD) 提供了微量移液器滴头形式的亲水介质 (N u T i p )。类似于反相介质，亲水性树脂的潜在缺点是蛋白质常常以变性的形式收回。相比之下，更重要的是固定化金
属亲和层析(I M A C )吸附剂的使用，以及最近包含有TiO₂的介质，已被有选择的用于M S分析前对磷肽类的浓缩和脱盐。这一技术在信号转导研究领域具有特殊的应用，因为检测低丰度的磷肽类对了解细胞的反应是至关重要的。最 近 的 一 份 报 道（Hsieh et al.，2007)描述了 T i O 2纳米颗粒基质的制备，它能够在可防止非特异性结合的含0.丨 ％ T F A和 5 0 % 乙腈( p H 2. 0) 的溶液中选择性的结合磷肽类。在这种情况下，洗 脱 由 P H 8. 5 的100 m m o l /L 磷酸铵来完成，它与磷酸化肽类的 M A L D I -M S 等检测相兼容，不需要进一步的脱盐过程。

使用高效液相色谱(H P L C )技术为质谱(M S )分析准备蛋白质样品的常规操作, 推动了供应商们去提供它们的吸着剂，成系列的柱子、套筒和毛细管等不断出现并持续增加。这反过来又允许通过使用柱切换程序使样品制备流线化。这种方法先用一个短的预装柱进行蛋白质样品的快速浓缩和脱盐，接着可以通过使用一个长柱，在 同 样 的 H P L C 系统对蛋白质进行高分辨率的分离。例如 ,P e p M a p 微量预装柱(Dionex，Sunnyvale, CA ) 可用于蛋白质样品的快速浓缩和脱盐，其填充床的长度仅为5 m m 。由于树脂使用的可选择性 ，分析物的捕集效率由选择的填料所支配，而样品体积的减少改善了随后层析步骤的分辨率。在此背景下，同样值得评论的是，整体分离材料正被越来越多地用于对蛋白质的浓缩和脱盐 (Schley et al., 20〇 6)。高 达 20um的有效孔径允许溶质快速传递透过整体基质。相比较于在基于颗粒吸附剂的亚微米级孔隙内实现的由较慢的扩散作用所介导的液相传质，整体介质可以实现在高流速低反压力条件下的高效分离，特别有益于通过柱切换进行快速脱盐。然而 ，在一个更直接的方法里，Mass-Prep c o l u m n (Waters ， Milford，M A )已被用于对疏水性基质中蛋白质的在线脱盐, 样品可直接注人E S I 质谱仪中( W h e a t
etal.， 2007)。此外，M A L D I -M S 分析的样品制备可以在不需要微量提取装置的情况下执行。所以 ，在将蛋白质分别加载到M A L D I 板之前，众多吸附剂已被用于对样品进行分批脱盐。最近发展的一个例子是Z n O 多 聚（甲基丙烯酸甲酯）纳米颗粒吸附剂，在进行M A L D I -M S 之前可以从蛋白质样品中消除饱和水平的N a C l (6.2 m o l /L )、N H ₄ H C O ₃(2. 6 m o l /L ) 或 I m o l /L 的 尿 素（S h e n et al. ， 2008)。相似的，脱盐作用通过使用一个疏水基质直接加入M A L D I 板的板孔中而实现(Jia et d . ， 2007)。在这种情况下，目标蛋白质被基质捕获, 接着通过使用一个最小限量的板上清洗实现样品的干燥、脱 盐 ，此时样品已可以进行M A L D I -M S 分析而不需要进一步的纯化。