蛋白质浓缩和溶质的去除实验（三）

三、透析

透析是基于分子质量大小的液相分离技术，它由透过半透膜的选择性扩散来实现。这种技术被认为是从大分子蛋白质中去除小分子溶质的最流行方法。特别是，这种非变性的脱盐技术允许在良性或生理条件下更换缓冲液，其影响目标蛋白质性质的风险可降到最低限度。

过去的十年里，透析的原理并没有改变，但用于透析的技术和工具却得到了改良。尤其 是 优 化 的 技 术 实 现 了 高 通 量（减 少 处 理 时 间 ），增 加 了 处 理 样 品 体 积 的 灵 活 性（从1 0 uL 〜 100 m L ); 改进了的透析膜形态减少了蛋白质的吸附和损失，提高了样品处理的方便性。

通常情况下，目的缓冲液 (透析液）的体积要比蛋白质样品的体积大若干个数量级。样品被转移到一个密封舱内，暴露于充当半渗透屏障的透析膜。透析膜通常具有特定的孔径, 即截留分子质量 (M W C O )，它允许分子质量小于这一限度的分子双向自由通过，而大分子物质 (如蛋白质) 则被截留。透析膜两边的缓冲液浓度梯度驱动溶质从浓度高的区域向浓度低的区域扩散 (图 9. 1)。扩散运输的流量可以用菲克扩散定律来描述。

有几个方面可以影响透析产品的稳定回收, 包括缓冲液交换所需的时间、透析系统的设计以及透析膜的化学和形态学特征。完成缓冲液交换所需要的时间取决于几个因素。可以通过提高分子穿过半透膜的固有扩散作用以减少透析过程的时间。基于前述的方程 ，物质转运可以通过增加膜面积或溶质的流量而得到提高。当样品体积很小时, 可以很容易的得到样品相对于透析液的一个很大的比率。然而, 蛋白质可吸附到透析膜而导致损失。在这样的背景下，需要评价增加膜面积或增加时间 (对于较小的膜面积) 所产生的影响。由于溶质的扩散系数随温度而变化，温度升高将加快分子运动，增加内在的扩散系数 ，从而导致更快的转运。然 而 ，升髙温度会对样品的稳定性产生不利的影响。由于样品的完整性往往是最重要的，因此可能需要预先确定能保持蛋白质稳定的最高温度。

透析系统的设计也可以决定进行有效透析的时间和产品回收的效率。溶质从样品中穿过膜扩散进入透析液的边界层。边界层中溶质的浓度髙于透析液中其他部位溶质的浓度 ，从而减少跨越膜的浓度梯度，抑制扩散的进行。然而 ，可通过介导透析液的对流流动或通过不停的搅拌来减小边界层。

当前，透 析 膜 和 透 析 管 的 机 械 设 计 使 其 可 以 对 范 围 广 泛 的 样 品 量（从 10 uL 〜100 mL) 进行加工处理, 其产品的损失可以忽略不计。传统的透析管在其可使用之前要经历复杂的准 备 。 Pierce Biotech (Rockford， IL) 提 供 的 SnakeSkin®透析管可以简化大体积样品的透析。这一技术的核心为褶状的再生纤维素膜 (3. 5〜 10 kDa M W CO)，便于快速 准 备 。在小体积样品透析的情况 下 ， Pierce 提 供 了 简 洁 的 SlideA-Lyzer®微型透析
器 (10〜 100 uL ) 和透析盒（0.1〜 30 m L ), 用于处理有限的小量生物样品。 这些透析器是一 次 性的杯子，由聚丙烯和再生纤维素制成，使用标准的实验室移液器可以很容易地移取样品。新的设计提高了对宝贵的小量样品的回收率。

1 浓 缩 和 亲 和 结 合 的 应 用

蛋白质缓冲液交换的应用主导了透析膜的使用。然而 ，透析技术在浓缩和大分子亲和结合相互作用领域的应用越来越多。

使用透析膜进行蛋白质的浓缩类似于双水相萃取，通过使用试剂（ 如聚乙二醇、葡聚糖等聚合物) 产生一个双相系统, 而透析膜则将这个两相分开 (Waziri etal. ， 2004)。根据该系统的设计，蛋白质可以自由的通过膜并与沉淀剂相互作用，随后得到浓缩，同时产品也得以回收。

这项技术被称为平衡透析, 它也被用于在血清结合测定中对候选药品的鉴定，研究抗原-抗体相互作用，以及评估使用其他方法无法检测的低亲和力相互作用。在平衡透析中，膜的选择需要满足以下条件: 所需的蛋白质或配体可以自由通过; 受体分子只能位于膜一边 ，且不能透过。当蛋白质扩散穿过膜时，其中的一些蛋白质将结合到受体上，而有些蛋白质则仍保留在溶液中。配体穿过膜并结合到受体上的扩散作用会持续进行，直到达到平衡。
配体槽中自由配体的浓度也可以用于检测样品的结合特性 (Waters et al. ， 2008)。

四、超滤

超滤 (U F ) 所利用的分离机制本质上相当于透析。两种技术都采用半渗透屏障或膜将样品 (包含有所需的产品或溶质) 从溶液中分离开来。膜的设计允许小分子质量的溶质(如盐) 渗过，而所需的产品则完全保留下来。超滤膜非常适用于浓缩生物制剂，因为它们可以在一个较宽的温度范围 (2〜26°C ) 内操作，而且不涉及相变化或化学添加剂，从而最大限度地减少了不稳定生物制品的变性和/或降解。将超滤与透析区分的作用有 3 个:①
应用;②操作模式;③膜的结构。首先，透析主要用于溶质或缓冲液的交换, 而超滤则应用于缓冲液交换或产品的浓缩。其次 ，透析是通过由半透膜两边的浓度差所驱动的扩散传作用而进行的，而超滤主要是由膜两边的压力差所驱动的传统的传质而起作用的。由于使用不同的驱动力进行溶质或溶剂的转移，用于超滤的膜的机械强度要比透析膜的大。压力驱动的超滤膜的设计可承受超过 75 psi①的高压力差。

一 般 情 况 下 , 有 3 种 模 型 方 法 已 被 用 于 描 述 通 过 超 滤 进 行 溶 质 转 运 的 真 实 机 制(Denisov， 1994)。其 中 的 一 种 超 滤 转 运 机 制 如 图 9. 2 所 示 。由压力 驱 动 的 液 流 促 使 溶质 和 溶 剂 向 膜 的 上 游 表 面 传 递 并 透 过 ，所施加 的 压 力 差 被 称 为 跨 膜 压 力（△P _tm ) 。如 果 膜可 以 完 全 保 留 住 一 个 给 定 的 溶 质（如 蛋 白 质），就 如 同 通 过 超 滤 进 行 浓 缩 的 情 况 一 样 ，C _滤出液=0, 保 留 下 的 溶 质 将 在 膜 的 上 游 表 面 积 累 ，将 导 致 膜 表 面 在 边 界 层 厚 度 δ 内 的 浓 度增 加 。这 种 现 象 称 为 「浓 度 极 化 “(concentration polarization)。 溶 质 在 膜 表 面 的 积 累 会 通过 几 种 机 制 影 响 溶 剂 过 滤 通 量 (J v) 。首 先 ，积 累 的 溶 质 可 以 产 生 一 个 沿 着 膜 的 渗 透 压 力差 ，驱 动 液 流 从 滤 液 向 原 料 或 渗 余 物 的 方 向 流 动 ，从 而 减 少 溶 剂 运 输 的 净 速 率 。对 通 量 的描 述 见 下 文和图 9. 2。

总 体 而 言 ，这 些 模 型 可 以 让 用 户 更 好 地 了 解 超 滤 工 艺 参 数 对 溶 质 和 溶 剂 流 量 的 影 响 ，并 可 以 依 此 优 化 条 件 来 提 高 膜 的 通 量 。这 些 模 型 最 重 要 的 应 用 可 能 是 开 发 设 计 可 进 行 大规 模 浓 缩 的 超 滤 系 统 ，对 昂 贵 的 产 品 (如 用 于 疾 病 治 疗 的 蛋 白 质 ) 进 行 浓 缩 ，在 此 ，浓 缩 工艺 的 生 产 力 和 回 收 率 都 是 至 关 重 要 的 。而 对 于 实 验 室 规 模 的 超 滤 , 这 些 因 素 不 是 最 关 键的 ; 但 在 用 于 小 规 模 制 备 的 超 滤 系 统 的 设 计 中 应 该 考 虑 这 些 因 素 。