在大肠埃布氏菌中生产外源蛋白时面临两个挑战: 一? 是所用蛋白质表达系统的表达水平很低; 二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体—包涵体中。弱启动子、低转录起始或稀有密码子的存在引起的表达问题都可以通过在装配过表达质粒时将矫正序列（correctivesequence) 引入基因中和使用补充了稀有 tRNA 的大肠杆菌来得到解决。
将高表达的内源性蛋白质融合在外源目标蛋白质的 N 端不仅是一个提高产量的方法，而且还可以增加目标蛋白质的可溶性: 这是可溶性标签的基本原理。
另外，亲和标签对蛋白质的纯化至关重要，它提供了多种策略使目标蛋白质结合在亲和基质上 (表 I6.1)。一些蛋白质标签既可作为亲和标签，又可作为可溶性标签。例如，谷胱甘肽-S-转移酶 (glutathione-S-tamsferase，GST) 可以提高某些蛋白质的可溶性，而可溶标签麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein,MBP) 也可用于目标蛋白质的亲和纯化。
亲和标签和可溶性标签在分子质量上差别非常大，因此它们给宿主细胞带来的代谢负担也有很大不同。例如，对一个具有 100 个氨基酸残基的融合有 MBP 标签 (43kDa) 的目标蛋白质来说, 要想获得 Img 的目标蛋白质就必须表达 5xng 的融合蛋白。亲和标签所要求的纯化费用也各不相同，有树脂本身的成本，也有操作过程中的花费 (再生与再使用的难易、洗脱试剂、结合能力等)。Lichty 等 (2005) 对 8 种亲和标签在纯化、产量、成本等多个方面进行了比较。目前, 也已经开展了许多类似的研究，一些综述对亲和标签 (Arnauetal.，2006b;Waugh，2005) 和可溶性标签（EspositoandChatterjee，2006) 进行了较好的总结 (Terpe，2003)，并列出了它们的优点和不足。
除去费用因素，选择哪种亲和标签通常取决于适合目标蛋白质纯化的缓冲液。组氨酸标签不适用于某些对氧化作用和蛋白质水解损伤敏感的蛋白质的纯化，因为固相金属亲和色谱（immobilizedmetalaffinitychromatographic，IMAC) 的介质不耐受还原剂或 EDTA。同样的，使用 IMAC 介质纯化对金属离子敏感的蛋白质时也要非常小心。相反，如果目标蛋白质需要变性环境或需要重折叠，那么组氨酸标签和 IMAC 纯化方法就是很好的选择。
在一些情况下，表达水平也能决定标签的选择—可溶标签如甘露糖结合蛋白 (mannan-bindingprotein,MBP)、硫氧还原蛋白标签（thioredoxin,Trx)、N 利用质 A(N-utilizationsubstanceA，NusA) 和谷胱甘肽-S-转移酶都有很强的翻译起始信号，能够驱动高水平的表达，这对于结构研究是非常有用的。另外，当需要低水平表达的时候，如当研究复合物或者生理相互作用的时候, 特异性更强的表位标签或串联标签就是更加合适的选择。
蛋白酶切割位点来去除。一些具有组氨酸标签的蛋白质已经实现了结晶，标签对蛋白质结构的影响很小或完全没有 (Carsonetal.，20 〇 7)。对某些蛋白质来说, 组氨酸标签实际上有助于蛋白质晶体的形成 [如 Smits 等 (2008)]。组氨酸标签也可以与商业来源的该标签特异性的抗体共同用于蛋白质的检测。
也有一些非标准的 6X 组氨酸形式的组氨酸标签。为了降低电荷或增加稳定性，这些标签的组氨酸序列中散布着别的氨基酸残基，如 HAT-标签和 6XHN 标签，它们能够更好地结合 Co2+-Talon 树脂（Clontech 公司）和 MAT 标签（metalaffinitytag)(SigmaAldrich 公司）
GST 是一种表达量很高的 26kDa 的真核蛋白质。研究显示，当融合在目标蛋白质的 N 端时，克隆自日本血吸虫 (Sc/iistosomajaponicwm) 的 GST 能够提高蛋白质的可溶性和表达量（SmithandJohnson,1988)。当 GST 位于 C 端时（图 16.1B)，其促溶能力相对较弱，但是仍然能够很好地起到亲和标签的作用。GST 可以与固定在树脂上的谷胱甘肽 (glutathione) 结合, 这可用于含有 GST 标签蛋白质的亲和纯化。融合蛋白结合在树脂上以后，可以在中性温和的条件下被游离的还原性谷胱甘肽 (10?40mrnol/L) 洗脱下来。
纯化 GST 融合蛋白所用的树脂，如谷胱甘肽琼脂糖微球 (glutathione^sepharosebead) 相对来说价格便宜, 而且有很高的载量（5?10 mgGST/mL 树脂），经过再生后可以多次使用。
要结合谷胱甘肽，GST 标签必须以正确的折叠形式存在，因此融合蛋白必须是可溶的且在非变性的条件下才能得到有效的纯化。GST 融合蛋白的表达量通常都很高，因此必须小心检测蛋白质的可溶性。对某些蛋白质来说,GST 具有可溶性标签的功能 [如 Kim 和 Lee(2008)]。GST 的底物 1-氣-2，4-二硝基苯（l-chloro-2，4dinitroben-zene,CDNB) 存在时，可以通过比色法 (c 〇 l 〇 rimetricassay) 对其进行检测（Habigetal.，1974); 当与树脂上的谷胱甘肽的结合不理想时，这个实验也可以用于监测融合蛋白中 GST 的折叠是否正确以及它的亲和力。同样可以用商业化的抗 GST 抗体来检测这个标签。
GST 标签比较大，这使其更容易被蛋白酶降解，因此 GST 融合蛋白的纯化应快速进行以使它的损失最小化。与含有组氨酸标签的蛋白质不同，可以使用含有 EDTA 的缓冲液制备 GST 标签蛋白样品以减少蛋白质降解。使用还原条件时一定要小心，因为 GST 有 4 个暴露在溶剂中的半胱氨酸，它们与蛋白质的氧化聚集有关。GST 在溶液中会形成同源二聚体，因此对寡聚蛋白来说，选择融合 GST 标签不是一个明智的选择。
GST 与谷胱甘肽的结合及洗脱都相对较慢，所以 GST 融合蛋白需要以较慢的流速上样和洗脱。因为谷胱甘肽在 280nm 处有很强的吸收，所以在洗脱时对蛋白质的监测要小心仔细地进行。
(1) 表位标签 一些可以被商业来源的抗体识别的短氨基酸序列可以作为检测和纯化蛋白质的标签使用。在分子生物领域中，添加表位标签（epitopetag) 作为追踪重组蛋白的一般做法已被广泛运用 (FritzeandAnderson,2000)，这种方法有很高的特异性，而且较小的标签可以将对目标蛋白质结构和功能的影响降到最小。这些标签通常加在 N 端或 C 端，也可以加在靶蛋白序列中（在环状结构中或结构域间的暴露于溶剂中的区域）。宿主细胞通常没有与表位标签相同的氨基酸序列，这使得对靶蛋白的检测变得容易。但是，对于纯化来说，表位标签结合的介质价格昂贵 (通常是被固定在色谱层析树脂上的单抗），与其他亲和纯化介质相比，不适合大规模的蛋白质制备。标签对应的短肽、低 PH 或其他方法 (如将标签结合所需的钙离子螯合掉，或者用盐或多元醇) 可以用来洗脱目标蛋白质，但是与其他亲和纯化的方法相比，它们中的一些方法会显得比较剧烈 (详见第 28 章）。
FLAG 标签是一种只有 8 个氨基酸残基 (DYKDDDDK) 的亲水性短肽标签，它可以用来进行目标蛋白质的检测和纯化（EinhauerandJungbauer,2001;Prickettetal.，1989)。除了可以利用一些高特异性的抗 FLAG 单抗, 还可以用 FLAG 标签中所含有的肠激酶 (enterokinase) 酶切位点（DDDK) 在纯化后彻底去除标签。FLAG 标签的一个变种是 3XFLAG 标签 (Sigma-Aldrich 公司）, 这种标签由 3 个串联重复的 FLAG 样序列组成 (Hernanetal.，2000)。其他常用的表位标签包括流感病毒血凝素表位标签 (influenzahemagglutininepitopetag,HAtag) 和 c~Myc 标签（FritzeandAnderson,2000)。
(2)S 标签 Raines 等 (2000) 对 S 标签进行过综述，利用了 RNA 酶 SCRNaseS) 的 N 端的 S-肽段 (1?20 位）与 S-蛋白（21?124 位残基）之间的紧密结合（RichardsandVithayarhil，1959)。S 标签系统使用了 S-肽段 N 端的 1?15 个氨基酸残基，还有固定在琼脂糖微球上的 S-蛋白来纯化目标蛋白质。通常来说，具有 S 标签的载体编码一个位点特异性的蛋白酶切割位点，可以通过将标签切掉或更剧烈的变性条件去破坏 S 标签和 S-蛋白之间的相互作用来进行蛋白质的洗脱。
(3)STREP-n 标签 STREP-II 标签 (WSHPQFEK) 利用了生物素（biotin) 与链亲和素（streptavidin) 之间强大的特异性相互作用（SchmidtandSkerm,1994)。这个肽标签结合在链亲和素的生物素口袋位置。Strep-Tactin 是经过了优化的能够结合 STREP-II 标签的重组链亲和素，已经用于亲和介质的制备。结合的目标蛋白质能够被较低水平 (2.5 mmol/L) 的脱硫生物素（desthiobiotin) 洗脱下来，脱硫生物素是一种生物素类似物，它能够以可逆的方式竞争性结合 Strep-Tactin(SkerraandSchmidt,2000)。洗脱条件比较温和，所用缓冲液能够含有高浓度 (达到 50 mmol/L) 的还原剂 (如 DTT 或者 i9■疏基乙醇），也能够含有螯合剂 (如 EDTA), 对于那些对氧化剂敏感的蛋白质来说，STREP-II 标签是一种极好的纯化方法。Strep-Tactin 层析法的树脂能够再生，可以反复利用数次。虽然大多数细胞提取物都含有少量的天然生物素化的宿主蛋白（biotinylatedprotem)，它们通常不会对纯化造成干扰，但是如果有必要, 可以在宿主蛋白中加人亲和素以除去生物素化的宿主蛋白（SchmidtandSkerra，2007)。也有一些研究尝试使用链亲和素/亲和素 (streptavidin/avidin) 作为融合标签，但是这些标签很难用于亲和纯化，因为这些蛋白质之间的相互作用太强以至于很难被破坏掉。
(4)CBP 标签 钙调蛋白结合肽（calmodulin-bindingpeptide,CBP) 是一种具有 26 个氨基酸残基的短肽。它来源于骨務肌肌球蛋白轻链激酶 (skeletalmusclemyosinUghtchainkinase) 的 C 端，能够特异性地结合轉调蛋白 [参考 Terpe(2003)]。固定在层析介质上的钙调蛋白（如钙调蛋白-琼脂糖凝胶）能够用来纯化具有 CBP 标签的目标蛋白质。
尽管钙调蛋白与 CBP 结合得非常紧密（亲和力在纳摩尔级），但是这种作用依赖于钙离子，结合的蛋白质可以用含有钙离子螯合剂的温和缓冲液 (如 EGTA)—步洗脱下来。因为 CBP 标签包含有蛋白激酶 A(proteinkinaseA) 的靶序列, 所以该标签的另一种用途是对融合蛋白进行 32P 同位素标记（Vaillancourtetal.,2000)。因为在真核细胞中很多内源性蛋白质能够与钙调蛋白产生互相作用，所以 CBP 标签不适用于真核表达系统。
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