在重组蛋白表达中，特别是当在细菌中表达真核蛋白时，主要的瓶颈在于蛋白质的正确折叠与可溶性。一些可溶性蛋白已被作为标签用来改善目标蛋白质的折叠。这些标签应该与其他方法共同使用来促进蛋白质的折叠，如诱导后降低培养温度或者共表达伴侣蛋白（BaneyxandMujacic,2004;deMarcoetal.,2007;Sahdevetal.，2008)，为了获得较高可溶性的目标蛋白质，有必要尝试多种可溶性标签 (PelegandUnger,2008)。对于那些特别难溶的蛋白质来说，可以尝试在变性的条件下纯化蛋白质，然后再进行重折叠 (CabritaandBottomley，2004;JungbauerandKaar，2007;Qoronflehetal.，2007; 详见第 17 章)。
因为 MBP 标签能够特异性地结合麦芽糖 (maltose) 和直链淀粉 (atnylose)，所以它不仅可作为一种可溶性标签 (diGmmetal,,1988)，而且能够有效地用于亲和纯化。MBP 是一个 43kDa 的大肠杆菌分泌型蛋白，它的表达水平很高并且能够提高融合在其 C 端的蛋白质的可溶性 (KapustandWaugh,1999)。近期的研究显示，融合在目标蛋白质 C 端的 MBP 也同样有效（Dysonetal.，2004)。MBP 很大，这给细胞的代谢带来很大负担，但一个高通量的测试显示，MBP 标签是最好的可溶性标签之一（DysonetaU2004;Kataevaetal.，2005)。但是, 大约有 1/4 的 MBP 融合蛋白依然是不溶的，或者在去除了 MBP 标签后蛋白质变得易于聚集^例如，我们使用大肠杆菌表达人降钙素基因相关肽受体组分蛋白（humancalcitoningene-relatedpeptide-receptorcomponentprotein,CGRP-RCP) 时发现，通过肠激酶酶切去除 N 端的 MBP 标签后出现了目标蛋白质的聚集，虽然该蛋白质已经得到了成功的表达和纯化 (Tolunetal.，2007)。每种可溶性标签的促溶效果是不同的，对于那些难溶蛋白质来说，需要尝试多种标签。硫氧还蛋白标签对于 CGRP-RCP 的表达是无效的，目标蛋白质仍然不溶。Nallamsetty 和 Waugh(2006) 认为，可溶性标签 (如 MBP 或 NusA) 在目标蛋白质的折叠中提供了帮助，去除标签后那些易聚集的目标蛋白质的可溶性由该蛋白质的自身性质决定，而不是所用的标签。
含有 MBP 标签的商业化载体具有多种标签去除位点 (NewEnglandBiolabs 公司），可以用于在胞质和周质中表达目标蛋白质。交联直链淀粉 (cross-linkedamylose) 树脂可以用来结合具有 MBP 标签的蛋白质，结合的融合蛋白能够很容易地被含有 10 mm01/1-麦芽糖的洗脱缓冲液洗脱下来。这使得具有 MBP 标签的蛋白质可以在温和的环境中经过简单的一步得到纯化。然而，淀粉亲和纯化法不能够在有还原剂或者变性环境中进行。
淀粉树脂会在一定程度上被粗提物中的淀粉酶降解，尤其是生长在丰富 LB 培养基的细胞的提取物，通过在培养基中加人葡萄糖 (〇.2%), 这种作用可以被降到最低。淀粉树脂可被再生并重复使用多次。
硫氧还蛋白（thi 〇 red 〇 xin，TrX) 是一种热稳定的、12kDa 大小的大肠杆菌胞内蛋白，该蛋白质很容易过表达，而且即使过表达至细胞总蛋白质的 40% 以上也仍然是可溶的 (LaVallieetal.，1993)，因此在重组蛋白制备中可以将其用做可溶性标签来避免包涵体的形成（LaVallieetaL,2000)。Dyson 等（2004) 的实验结果显示，Trx 标签加在目标蛋白质的 N 端可以发挥更好的作用。
硫氧还蛋白会积聚在细胞质膜的黏附位点上（BayeretaL,W87)，这使得 Tnc 融合蛋白能够经简单的渗透压或冻融处理释放出来，这提供了一种简单的初步纯化。通常会在 Tnc 标签外再添加另外的亲和标签，如组氨酸标签，以进行进一步的纯化。
N 利用物质 A 转录抗终止因子（iV-utilizingsubstanceAtranscriptionantiterminationfactor，NusA) 是一个具有 495 个氨基酸残基的大蛋白质，根据一个可溶性统计模型 (statisticalsolubilitymodel)，与外源蛋白融合表达时，NusA 是大肠杆菌蛋白中可溶性最好的，这是选择其作为可溶性标签的原因（Davisetal.，1999;DeMarcoetaL，2004)。
在一些高通量的筛选测试中，NusA 作为可溶标签与 MBP 效果相似甚至好于 MBP 标签。
但是，对不同蛋白质来说会有不同的结果。NusA 标签通常与其他亲和标签一起使用，如组氨酸标签。
目前，已经研发了一些比较小的溶解性增强标签（solubilityenhancementtag，SET) 或者溶解性增强肽 (solubilityenhancementpeptide，SEP) 标签，这些标签利用高度酸性序列来增强某些目标蛋白质的可溶性 (KatoetaL，2007;ZhangetaL，2004)。其他的一些小标签有 GBl 标签 (56 个氨基酸残基），该标签基于链球菌蛋白 G(streptococcalproteinG) 的 IgG 结合 BI 结构域 (ChengandPatel，2004;Zhouetal.，2001) 还有蛋白 A 的 IgG 结合结构域 (ZZ 结构域，116 个氨基酸残基；InouyeandSahara，2009;Rondahletal.，1992)。这些比较小的标签对制备用于核磁共振（NMR) 研究的蛋白质样品尤其有用 (KatoetaL，20 〇 7)。另夕卜，在使用蛋白质连接法 (proteinligationmethod) 创建 NMR 不可见的可溶性标签方面也取得了一些进展（Durstetal.，2008;Kobashigawaetal.，2009) 〇研究显示，融合在目标蛋白质 N 端较小的泛素样修饰物 (smallubiquitin-likemodifi?er，SUMO) 蛋白 (大约 11kDa) 能够极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性（Marblestoneetal.，2006)。在目标蛋白质纯化完成后，可用识别 SUMO 结构的 SUMO 蛋白酶 (Ulpl 的催化结构域）去除该标签（Leeetal.，2008;Panavasetal.,2009)。SUMO 融合系统也已经通过改造用于昆虫细胞和其他真核表达系统（Liuetal.,2008)。
Halo 标签是最近构建的模块化标签系统（modulartaggingsystem), 该系统具有一个大小为 34kDa 的、经过改造的卤代烧脱卤素酶 (haloalkanedehalogenase) 蛋白，它可以结合多种合成的配基（HaloTag 配基；Promega 公司）。这些配基的成分包括一个与 Halo 标签共价结合的恒定的反应性接头和一个可变的报告末端，该末端能够赋予融合蛋白许多有用的性质。因此，单一的标签可以用于活细胞的亚细胞结构成像、细胞标记和分类、亲和纯化及固相支持物上的固定（Losetal.，2008)。Ohana 等（20 〇 9) 使用了一个此类标签（HaloTag7) 与附着在琼脂糖微球上的氯烧烃接头（chloroalkanelinker) 进行了亲和纯化。因为 Halo 标签能够以一种高度特异的不可逆的方式与接头共价结合, 所以即使极低表达量的蛋白质也能够高效地结合在氯烷烃树脂上。可以使用烟草蚀纹病毒蛋白酶 (tobaccoetchvirusprotease,TEV) 将目标蛋白质洗脱下来，该酶可以切割位于 Halo 标签和靶蛋白之间的切割位点。令人惊讶的是，使用一组在大肠杆菌中难以表达的重组蛋白进行的测试表明，这种紧凑的单体 Halo 标签可以显著地提高融合蛋白的可溶性 (OhanaetaL，2009)。在这些实验中，Halo 标签的表现要大大好于 MBP，确实显示出了可溶性标签的功能。
由于蛋白标签可能会干扰目标蛋白质的正常功能，所以在完成其促进溶解或亲和纯化的作用后，标签的去除对于生物学和功能研究很有帮助，对 GST 或 MBP 这样的大标签尤其如此，尽管有一些例子显示融合了标签的蛋白质更易结晶 (Smythetal.，2003)。
大多数用来向目标蛋白质添加标签的商业化表达载体也引入了具有特殊序列的切割位点，使用重组的蛋白内切酶可以去除标签。融合蛋白的亲和纯化完成后，可以使用蛋白内切酶来处理样品以切掉标签，再过一遍亲和柱后标签与重组蛋白会被分开，收集流穿液就会得到目标蛋白质。重组蛋白内切酶通常也会带有亲和标签，这样就可以在酶切反应完成后将其轻松去除。
表 16.3 列出了一些常用的蛋白内切酶。因为肠激酶和因子 Xa 在识别位点的 C 端进行切割，这样就可以将标签和识别位点序列完整去除，因此它们对去除 N 端的标签非常有用。但是，这两种酶有时特异性不是很强, 会在位于其他碱性残基处的次级切割位点进行切割。凝血酶 (thrombin) 是另一个用于去除标签的蛋白酶，它也具有相似的次级切割位点（JennyetaL，2003;LiewetaL，2005)。用凝血酶这样的蛋白酶去除标签，尤其是对于大规模的蛋白质制备, 与其他高特异性的酶相比，它的好处在于价格低廉且效率更高。
PreScission 蛋白酶是一种具有更长的、更严谨识别序列的特异性更高的蛋白酶。它由来自于人鼻病毒-14(humanrhinovirus-14) 的蛋白酶 3C(3Cpro) 和 GS 丁标签组成，GST 标签的存在使得该酶对于移除 GST 标签非常有用。另外一种非常特异且受欢迎的蛋白酶是烟草蚀纹病毒蛋白酶（Kapustetal.,2001), 该酶切割位点后的第一个氨基酸倾向于甘氨酸 (表 16.3), 但也能够容忍其他氨基酸残基，只是切割活性会有少许下降。这使得该酶很多时候都能够将 N 端标签完整去除，在目标蛋白质上不会留下任何多余的残基 (KapustetaL，2002)。可以很容易地自己制备大量的烟草蚀纹病毒蛋白酶，通常该酶会带有一个组氨酸标签以易于纯化及在切割反应完成后将其除去（Tropeaetal.,2009)。
商业公司出售很多类型的烟草蚀纹病毒蛋白酶，它们有的带有别的亲和标签，有的具有更高的活性及稳定性。
烟草蚀纹病毒蛋白酶的一个变种是烟草脉络斑点病毒蛋白酶，其具有不同的识别序列 (Nallamsettyetal.,2004)，能够切开位于两个不同标签之间的切割位点（图 16.1C)。
外切蛋白酶也可以用来去除 N 端标签，如 TAGzyme 系统 (Arnauetal.，2006a，可从 Qiagen 公司购买）。这个方法使用/二肽氨基肽酶 I(dipeptideaminopeptidaseI,DAPase) 来逐步消化 N 端的标签直至一个二肽的终止点。已经设计出了多种类似的系统用于处理不同的序列（Arnauetal.，2006b;2008)。
完整去除 C 端的标签是比较困难的，因为大多数蛋白内切酶只在识别序列的 C 端进行切割。如果有必要完全去除标签，可以设计更加特异的酶切位点，这些位点的识别是以结构为基础的 (如 SUM? 蛋白酶;Malakhovetal.,2004)。或者利用自催化蛋白自剪接兀件（autocatalyticproteinself-splicingelement)(Inteins;SalehandPerler，2006)。这两种切割系统都加上了亲和纯化标签—SUM? 融合系统（Buttetal.,2005;Leeetal.,2008): 包括蛋白质内含子-几丁质结合结构域 (chitin-bindingdomain，CBD; 由 NewEnglandBiolabs 公司将其作为商品化的 IMPACT 系统;Chongetal.，1997) 或蛋白质内含子-聚经基丁酸醋结合蛋白（polyhydroxybutyratebinding) 和类似的蛋白质纯化系统 (Gilliesetal…?2008)。
在一些情况下，标签也可以用化学方法去除。尽管化学切割方法所用试剂价格低廉并且非常有效，但是这些反应需要剧烈的溶剂及导致变性的条件, 所以通常只用于小肽的制备。溴化氰 (CNBr) 可切割甲硫氨酸，当融合蛋白能够被设计成只有一个甲硫氨酸且位于标签和目标肽段之间，可以使用这种试剂 (D6belietal.,1998;FairlieetaL,2002)。另外一种化学切割试剂，羟胺（hydroxylamine)，能够切割天冬酰胺与甘氨酸之间的肽键 (Huetal.,2008) 〇实际应用中需要考虑的问题: 尽管在标签和目标蛋白质之间设计特异性的切割位点相对比较简单，然而标签的有效切割并不会总是发生且也难以预测。对于每一个表达构建体都要用实验检测切割效率。当使用特异性不强的酶时，还要检测可能发生在次级切割位点的切割。通常酶的用量和孵育时间需要摸索以使其最优化。切割效率的最大化对于寡聚蛋白质尤其重要，为了目标蛋白质的高产量，必须去除每一个单体上的标签 (Kenigetal.,2006)。需要切割的序列也需要在空间上能够让蛋白酶接触得到，并且相对地没有形成复杂结构; 在识别序列和目标蛋白质之间引入数个残基的间隔序列或接头序列，或者将不可能形成二级结构的序列放置在切割位点附近, 有时这都可以克服切割效率低下的问题。对于没有亲和标签的蛋白酶来说，柱上切割 (将蛋白酶注入结合有融合蛋白的亲和柱）比批式反应 (batchreaction) 更加有效。
很多种蛋白质标签都可以用于促进重组蛋白的表达和纯化。但是，即使有如此庞大的标签库, 结构基因组学的蛋白质制备机构得到可溶性纯蛋白质的成功率也低于 50%(StructuralGenomicsConsortiumetal.,2008)。尽管这些大规模的研究项目设计出/许多很好的策略, 考虑到蛋白质折叠的多样性及它们之间不同的生物化学性质，并没有一套通用的可溶性或者亲和标签适用于所有蛋白质。标签的选择在很大程度上还是依赖于需要表达的蛋白质以及制备蛋白质的目的。在此，我们已经评述了大部分的有效的蛋白质表达标签以及与它们使用相关的问题。
首页
