非洲爪蟾生发泡内含物的涂布制备实验

实验材料 雌性非洲爪蟾

试剂、试剂盒 OR2 培养液“5:1” 分离液分散剂

仪器、耗材 培养皿

实验步骤

1. 从麻醉了的雌性非洲爪蟾中取一块卵巢，放在盛有温度为 18~22℃ 的 OR2 培养液的培养皿（60 mm x 15 mm ) 中。

OR2 培养液：

82.5 mmol/L NaCl

2.5 mmol/L KCI

1.0 mmol/L CaCl2

1.0 mmol/L MgCl2

1.0 mmol/L Na2HPO4

5.0 mmol/L HEPES

2. 用珠宝镊子分离单个卵母细胞或一小堆卵母细胞并转移到一个新鲜的 OR2 培养皿中。在 18~22℃（不是在4℃）放 18~24 小时。这段时间结束的时候，几乎所有卵母细胞，其至最大的卵母细胞都有转录活跃的含有大量灯刷染色体环的染色体。前面所推荐的使用促性腺素对雌性非洲爪蟾进行预处理并不是必需的。

3. 选一个直径 1.0~1.1 mm 的卵母细胞放在盛有“5:1”分离液的小培养皿 （35 mm x 15 mm) 中。用两把珠宝镊子，在动物半球（黑色半球）上撕一个大口子，从伸出的细胞质中找到生发泡并把它弄下来。

“5:1” 分离液，pH 7.0

83.0 mmol/L NaCl

17.0 mmol/L KCl

6.5 mmol/L Na2HPO4

3.5 mmol/L KH2PO4

1.0 mmol/L MgCl2

1.0 mmol/L DTT

4. 20 秒内把完整的生发泡转移到一个盛分散剂的培养皿中。

分散剂：

20.7 mmol/L NaCl

4.3 mmol/L KCl

1.6 mmol/L Na2HPO4

0.9 mmol/L KH2PO4

1.0 mmol/L MgCl2

0. 01 mmol/L CaCl2

1.0 mmol/L DTT

0.1% 低聚甲醛

5. 快速操作，用珠宝镊子去掉核膜并把仍然完整的细胞核内含物转移到已放满分散剂的显微镜载玻片涂布小室中，加上盖玻片并用凡士林封上。细胞膜内含物会在几分钟内分散，沉在小室的底部。

6. 玻片在 5~10℃ 以大约 5000 g 离心 30 分钟。

7. 离心后，玻片垂直放到盛有 PBS + 2% 甲醛的染色培养皿中。平推盖玻片，然后放在那儿1~2 小时別动。

8. 到这一步，如果核内含物牢牢贴在玻片上，就用刀片去掉涂布小室。