实验方法原理 本方法是由 Jaffe 等 [ 1973 ] 的方法改写的。
实验材料 D-PBSA胰蛋白酶EDTA人脐带胶原蛋内酶H冷的新生小牛血
试剂、试剂盒 Hank平衡盐溶液HBSS PSG70%乙醇HUVRC生长培养液
仪器、耗材 培养瓶手术刀和22号刀片手术针20ml注射器鳄鱼夹动脉夹尖头剪棉纸铝箔塑料薄膜或莎纶封皮软木板很坚韧的线Luer接合管
实验步骤
内皮细胞的分离
1. 用铝箔覆盖软木板。
2. 将棉纸铺在铝箔上面，然后用 70 % 乙醇浸泡。
3. 挤出脐带中的血液。
4. 切除脐带一端 2 cm 或 2 cm 以上，包括动脉夹痕迹处。
5. 将 Luer 接合管外套插入静脉。
6. 用针将脐带钉在软木板上，但注意勿穿经血管腔。
7. 用手术刀和手术镊剥出一段静脉，长约 2 cm。
8. 缝线固定接合管，紧紧打结两次。
9. 夹闭脐带另一端，将 20 ml 注射器接在接合管上，再将 25 ml D-PBSA （放在冰上）注入脐带。靠 D-PBSA 的压力将静脉扩张。检査脐带是否有小孔。如有小孔，用鳄鱼夹夹持脐带，使小孔闭合，但不要夹闭静脉。
10. 将 D-PBSA 自脐带排人废液瓶。
11. 切除脐带另一端，插入接合管，如步骤 8 缝线固定。
12. 用另一只注射器将 25 ml 胶原蛋白酶液（胶原蛋内酶 H：是从溶组织梭状芽孢杆菌提纯的（1074059，Roche）。0.5 mg/ml， 用 M199 配制 25 ml）注入脐带，直至脐带膨胀。
13. 用乙醇喷过的塑料薄膜将脐带包裹，在 37°C 条件下放置 8 min。
14. 将胶原蛋白酶液挤出脐带，同时回抽注射器。
15. 拔出注射器，将胶原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS（冷的新生小牛血清，5 ml） 的试管。
16. 在脐带另一端换注射器，将 25 ml D-PBSA 注入脐带。
17. 挤压或拍打整段脐带一会儿，然后用此端的注射器抽取 D-PBSA。
18. 将抽取的 D-PBSA 注入在步骤 15 使用的试管。
19. 在 4°C 条件下离心（210 g，10 min）。
20. 用 5 ml HUVFC 生长培养液混悬细胞。
21. 吸去培养瓶内多余的明胶溶液，接种细胞。
22. 第 2 天从培养瓶吸去培养液。
23. 用 D-PBSA 洗两次，然后加入 HUVEC 生长培养液（M 199 培养液，添加 Hank 盐、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、20% FBS、150 U/ml 青霉素和链霉素混合液以及从牛脑提纯的内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growth supplement，ECGS）。使用 Roche 公司生产的 EGGS （1033484，75 mg）时，25 μg/ml，并用 5 μg/ml 肝素，也可使用 Sigma 公司的产品（E2759，15 mg），30 μg/ml，并用 10 μg/ml 肝素）。
维持培养
24. 吸去一半培养液，加入新鲜培养液，每周 3 次。
25. 大约每周传代一次。将胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培养瓶，收集细胞，然后按 1 : 2 传代。
26. 不要使用超过 6 代的细胞。
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