基本方案通过蔗糖梯度浮选 法 制备 去 污剂 抗 性的 膜 并 通 过免 疫 印 迹 对蛋 白质进行分析
材 料
细胞，贴壁或非贴壁
N E /P 缓冲液，单独或包含以下一种或多种组分：
1 % 、 2 % 或 5 % (W V ) TritonX-IOO
0.lmol/L 碳酸钠， pHll
5 % 、 3 5 % 或 8 0 % (m /V ) 蔗糖
60m m o l /L 辛基葡糖苷
T N E 缓冲液
去污剂相容的蛋白质检测试剂盒（如 Bio-Rad)
2 X 或 6 X S D S /样品缓冲液
丙 酮（可选），冰冷的
乙 醚（可选）
I O c m 的 组 织 培 养 皿（用于贴壁细胞）
22 G 针头
I m l 和 5m l 的注射器
S W 4 1 转子和超速离心管（B e c k m a n )
对于贴壁细胞，无需进行比较的细胞系
la. 将细胞铺于 2 个 I O c m 组织培养皿中，生长至细胞汇合。对 于 D R M 脂 质 分 析（见辅助方案3)，则接种细胞至5 个 培 养 皿 或 1 0 个培养皿以定量磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇或含量稀少的神经节苷脂。
2a. 用 I m l 含 有 1 % 或 2 % Triton X -100 的 T N E / P 缓冲液置冰上裂解细胞20 min。如果有必要，在裂解缓冲液中加入0. lmol/L 碳酸钠， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂类得率，提 高 D R M 脂质得率，或减少外周或细胞骨架蛋白与D R M 的结合。在分析 D R M 中的酶活性时，不能使用碳酸盐。
3a. 用细胞刮或橡皮刮将培养皿细胞裂解物刮下来，收于管中。
4a. 如果溶解缓冲液含有碳酸盐，将裂解液通过带 22 G 针 头 的 5m l 注 射 器 1 0 次（保持裂解产物低温）用于剪切 D N A ，以确保D R M 移至正确的梯度。
对于贴壁细胞，细胞间需进行比较的细胞系
lb. 如需比较两个不同的细胞类型间D R M 的丰度和得率，按照步骤Ia所示用培养皿培养不同细胞类型的细胞，对每种细胞另接种一个培养皿（以测定培养物的蛋白质含量），确保每个培养皿的细胞数相同。
2b. 用 5 ml T N E 缓冲液漂洗每种类型细胞的一个培养皿2 次 ，用 I m l 含 有 1 % TritonX -100或 者 0. lmol/L 碳酸钠的 T N E /P 缓冲液裂解细胞。将黏稠的细胞裂解物立即转 移 至 1.5m l 微量离心管内，并 通 过 22 G 针头连接的 I m i 注 射 器 1 0 次（或直到黏滞性消失）以剪切D N A 。然后以最大速度离心。
3b. 用去污剂相容的蛋白质检测试剂盒测定5〜IOul等份裂解物的蛋白质含量。将 T N E缓冲液与含有2 % 或 5 % Trit〇n X -100的 T N E 缓冲液混合，来制备含有足量TritonX -100的 T N E /P 缓冲液，使 用 去 污 剂 ：蛋 白 质 为 10 : I (m /m ) 混 合 。为增加与脂筏结合较弱蛋白质的得率，使用去污剂：蛋白质为2 : 5 (m /m ) 混合。
4b. 加 入 I m l 含 有 1 % Triton X -IOO 的冰冷T N E /P 缓冲液至剩余的培养皿中，在冰上裂解细胞20 min，在裂解缓冲液中加入0.lmol/L 碳酸钠， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂类得率，提 高 D R M 脂质得率，或减少外周或细胞骨架蛋白与D R M 的结合 。在分析 D R M 中的酶活性时，不能使用碳酸盐。按照步骤3a 所示操作；如果有必要，按照步骤4a 所示操作。
对于非贴壁细胞
Ic. 培养约5X 107个细胞，并 4°C ， 200g离 心 5 min。如需进行细胞间的比较时，应使细胞(来源相同）数量相同。对于脂类分析（见辅助方案3)，使 用 2X 108的非贴壁细胞。
2c. 用 5m l 冰 浴 的 T N E 缓冲液重悬细胞，重 复 洗 2 次 。
3c. 用 2m l 含 有 1 % 的 Triton X -100的 T N E /P 缓冲液在冰上裂解细胞20 min。在裂解缓 冲 液中加入〇.lmol/L 碳 酸 钠 ， p H l l ，以 便 更 好 地 定 量 D R M 脂 类 得 率 ，提髙D R M 脂质得率，或减少外周或细胞骨架蛋白与D R M 的结合。在 分 析 D R M 中的酶
活性时，不能使用碳酸盐。
4c. 如果有必要，按照步骤4a 进行操作。
5 . 将裂解产物与含有8 0 % 蔗 糖的冰冷T N E /P 缓冲液混合。对于来自贴壁细胞的裂解物 ，需要上述加至培养皿中的裂解缓冲液总体积为1.25倍 体 积（即对于 步 骤 3a 或4b 收集的裂解物，加 1.25 ml)。对于非贴壁细胞的裂解物，加 2. 5m l 。完全混合并静置几分钟以便减少泡沫。
6 . 转移至一个或多个S W 4 1 超速离心管内，移去可能存在的泡沫。每管不超过5 ml。用冰冷的含有3 5 % 蔗 糖 的 T N E /P 缓 冲 液 6〜7m l 小心地覆盖到裂解物/蔗糖复合物上(分层应尽可能的宽），开始倒入液体时应注意观察以确保其可以浮在上层。如果没有浮起，则从微量离心管中移去混合物，并彻底混合。如果必要的话，加入少量的8 0 % 蔗糖。
7 . 用 含 5 % 蔗 糖 的 冰 冷 T N E /P 缓 冲 液 填 充 离 心 管 至 距 离 顶 端 约 3m m 。配 平 ， 4°C ，l 〇0 00Qg 离心> 3 h (至 24 h)。
蛋白质梯度分布的检测
8a. 从底端分段收集梯度上的成分，每 份 收 集 lml。加 2 X 或 6 X S D S /样品缓冲液，通过 SDS-P A G E (单 元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹 法（单 元 12. 5 ) 分析其中 50〜100ul 组分。
对于无需免疫沉淀的免疫印迹
8b. 用 5m l 注 射 器 22 G 针头从离心管的顶端在 5%/35% 蔗糖交界处收集可见的条带置于 1 个 S W 4 1 超速离心管中。用 冰 冷 的 T N E /P 缓冲液稀释该膜成分，直到注满离心管。 4°(：， 100 00(^离心 111。
9b. 移弃上清液。用 100〜2 0 0 4 T N E /P 缓冲液移出沉淀物并移至一微量离心管内。用200ul T N E /P 缓冲液清洗超离心管 3 次 ，刮擦管底部以收集沉淀物碎片。将这些清洗液与沉淀物合并。
10b. 4°C ，最高转速离心 IOmin 以沉淀 D R M 。弃上清液。直接用 2X 或 6X S D S /样品缓冲液溶解 D R M ，通 过 SDS-PAGE (单元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 进行分析。
对于低分子质量蛋白质
8c. 依步骤 8b〜IOb 制 备 D R M 沉淀物，不 用 S D S /样品缓冲液来溶解。加 I m l 冰冷的丙酮 至 D R M 沉淀物里，涡旋混勻，置 冰 上 孵 育 lOmin。 4°C ，最 高 转 速 离 心 lOmin，移弃丙酮。
9c. 在室温下加 I m l 二乙基醚至管内，涡旋混勻，如上述操作进行沉淀。移去醚并风干。用 2 X 或 6X S D S /样品缓冲液溶解 D R M 蛋白，以 S D S - P A G E (单 元 12. 3 ) 和免 疫 印 迹 法（单 元 12. 5 ) 进行分析。
免疫沉淀后的免疫印迹
8d. 依照步骤 8b〜IOb 制 备 D R M 沉淀物，不 用 S D S /样品缓冲液来溶解。用 I m l 含有1 % Triton X -IOO 的 T N E /P 缓 冲 液 溶 解 D R M ，置 37°C 孵 育 5 min，或 者 加 入 Iml含 有 60m m o l /L 辛（烷）基葡糖苷的 T N E /P 缓冲液，置冰上孵育 20 min。
9d. 4°C ，最高转速离心 5 min，以沉淀任何残存的不溶性物质。将澄清的可溶性 D R M移至新管，通 过 免 疫 共 沉 淀 试 验（单 元 12. 2 ) 回收目的蛋白，以 S D S - P A G E (单元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹 法（单 元 12. 5 ) 进行分析。
备 选 方 案 用 离 心 法 制 备 去 污 剂 抗 性 的 膜
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