实验方法原理

葡萄球菌蛋白 A 可以结合数种哺乳类动物的免疫球蛋白。蛋白质 A-琼脂糖介质可以结合部分 IgM、大部分 IgGl 及几乎所有的 IgG2a、IgG2b 和 IgG3 MAb。

实验材料 腹水（单克隆抗体）

试剂、试剂盒 蛋白 A-琼脂糖 CL-4BTr1s 缓冲液 pH 8.6柠檬酸盐缓冲液 pH 5.5乙酸盐缓冲液 PH 4.3甘氨酸•Cl 缓冲液 pH 2.3中和缓冲液 pH 7.7

仪器、耗材 2.5 cm 玻璃层析柱紫外流通检测仪紫外分光光度计和石英比色杯超滤器及 ×M50 超滤膜

实验步骤

1)将蛋白 A-琼脂糖置于 50 倍体积的 Tris 缓冲液中充分溶胀。在室温下将其灌入直径为 2.5 cm 玻璃层析柱中，用 Tris 缓冲液平衡。

10-20 mL 腹水中的抗体，可用干重大约为 3 g 的蛋白 A-琼脂糖纯化。

2)腹水液稀释于 3 倍体积的 Tris 缓冲液，以 1-5 mL/min 的速度上样于蛋白 A-琼脂糖柱，用 Tris 缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白质都被洗脱，采用 A280 监测流出液。

3)依次用 2-3 倍柱床体积的柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸•Cl 缓冲液连续洗脱结合蛋白质，洗脱液直接接入装有中和缓冲液的管中。中和缓冲液的体积应为所收集液体积的 1/4。

4)采用 ELISA 法检测洗脱液的抗原特异性 MAb。

5)在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到 1-5 mg/mL，所用超滤膜为 ×M50。将单克 隆抗体储存于-20℃。测定 A280。以计算抗体浓度，鼠的 IgG 溶液 1 mg/mL=1. 44 吸光度单位。

注意事项

另一种缓冲液系统（由 Amersham Pharmac1a B1otech 建议的）对于某些单克隆抗体具有更高的结合能力。这些备择的缓冲液如下所示:

甘氨酸-OH 缓冲液（替换 Tris 缓冲液）

0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 6.0 及 pH 5.0 (替换柠檬酸盐缓冲液）

0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 4.0 (替换乙酸盐缓冲液）

0.04 mol/L 柠檬酸钠/0.02 mol/L 氯化钠 pH 3.2 (替换甘氨酸•Cl 缓冲液）