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细胞膜完整性及膜转运功能检测实验

2020.8.18
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

1. 主要试剂的的配制

碘化丙锭(PI)染色液(4℃ 避光保存):Pl,100 μg/ml;TritonX-100,1.0%;NaCl 0.9%。


2. 操作流程

2.1 样本的准备


2.1.1 培养细胞收集悬浮细胞于 Eppendorf 管中。贴壁细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,1000r/min离心 5 min。


2.1.2 新鲜实体组织取材组织用 PBS 漂洗干净后,浸泡在含 PBS 的平皿或青霉素小瓶内,用眼科剪尽可能将组织剪碎,吸去上清液,组织块转入大瓶中加入 10~20 ml 酶(200 μg/ml胶原酶),37℃ 消化 30 min,在不锈钢网上轻轻研磨,使组织和细胞分离,用 200 目筛网过滤 2 次。


2.1.3 石蜡切片组织切 50 μm 厚切片 4 张,置玻璃试管中,加二甲苯 5 ml,脱蜡 3×5 min,无水乙醇洗3×5 min,蒸馏水洗 5 min,加 2 ml 0.5% 胃蛋白酶(pH 1.0),振荡消化 30 min,PBS 洗终止消化,最后用 200 目筛网过滤2次。


2.2 染色方法

制备好的单细胞悬液可用70% 乙醇固定,4℃ 保存备用。染色前用PBS稀释单细胞,离心沉淀,弃上清,加入 200 μl RNA 酶 A,37℃ 水浴30 min,再加入 800 μl PI 染色液,混匀,4℃ 避光孵育 30 min。


2.3 上机检测记录

激发波长 488 nm 处红色荧光。


3. 结果观察

细胞凋亡时,G1 峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。在光散射图谱上,前向光散射低于正常,侧向光散射高于正常。细胞坏死时,细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少,亚二倍体细胞量多少不等。在光散射图谱上,的向光散射和侧向光散射均高于正常。


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