83. 用作测序的 2 ul PCR 产物（所需的确切用量取决于测序的方案，并应当优化）用下述方法处理：
0.1 ul 外切核酸酶 I
0.1 ul 虾碱性磷酸酶
1.8 ul 50 mmol/L Tris·Cl，pH 8. 0
加 2 ul 消化混合液到 2 ul DNA 中。
84. 在热循环仪上进行反应，37°C 温育 15 min, 然后 80°C 加热 15 min。加水到 15 ul。直接取 2 ul 稀释的 PCR 产物测序。
85. 从 SAGEnet 下载 SAGE 的分析软件（见因特网资源），按说明分析。
收起
注意事项
其他
1. 材料：
感兴趣的细胞或组织
2. 试剂：
含以下成分的 Dynbeads mRNA DIRECT 试剂盒（Dynal Biotech）：
Dynbeads oligo （dT）25
裂解/结合缓冲液
洗涤缓冲液 A
洗涤缓冲液 B
10 mmol/L Tris·Cl 再生缓冲液
储存缓冲液oligo （dT）25
20 mg/ml 糖原，分子生物学级（Roche Diagnostics）
含以下成分的 SuperScript Choice System cDNA 合成试剂盒（Life Technologies）：
5×第一链缓冲液
DEPC 处理的双蒸水（DEPC ddH2O）
0.1 mol/L DTT
10 mmol/L dNTP
200 U/ul SuperScript II 逆转录酶
5×第二链缓冲液
10 U/ul E.coli DNA 连接酶
10 U/V E.coli DNA 聚合酶 I
2 U/ul E.coli RNase H
5× T4 DNA连接酶缓冲液
1 U/ul T4 DNA 连接酶
0.5 mol/L EDTA， pH 8.0
2×BW缓冲液
0.1％ （m/V） SDS
100× 乙酰化的 BSA （New England Biolabs）
NlaⅢ 和 NEB 缓冲液 4 （New England Biolabs），保存在 -80°C
LoTE缓冲液
1％ （V/V）Tween 20
连接子
5 U/ul 高浓度的 T4 DNA 连接酶（Life Technologies）
BsmFI （New England Biolabs）
PC8
SeeDNA （Amersham Pharmacia Biotech）
3 mol/L 乙酸钠
70％ 和 100％ 乙醇
DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段和 10× 缓冲液（Amersham Pharmacia Biotech）
3 mmol/LTris·Cl，pH 7.5
10× SAGE PCR 扩增缓冲液
DMSO （Sigma）
PCR引物
5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶（Life Technologies）
7.5 mol/L 乙酸铵（Sigma）
5× 上样缓冲液
预制的 20％ （m/V）微型聚丙烯酰胺/TBE凝胶（Novex）
20 bp DNA ladder （GenSura）
SYBR Green I （Roche Diagnostics）
10× TBE凝胶电泳缓冲液
Qiaquick凝胶抽提试剂盒（Qiagen； 可选）
10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE凝胶
1 kb 的DNA参照
pZErO-1 质粒（Invitrogen）
SphI 和 NEB 缓冲液 2 （New England Biolabs）
TE缓冲液，pH 8.0
SOC培养液
0.01 ng/ul pUC19 对照质粒 DNA
DH10B电转感受态细胞，冷冻（LifeTechnologies）
含 100 ug/ml 氨苄抗生素的 LB 平板
10 cm含 zeocin 的低盐 LB 平板
Pfu DNA 聚合酶 I （Stratagene）
外切核酸酶 I （USB）
虾碱性磷酸酶（USB）
50 mmol/L Tris · Cl， pH 8.0
3. 仪器耗材
0.5 ml 和 1.5 ml 无 RNase 的硅烷化的微量离心管（Ambion）
1.5 ml 微量离心管的磁座（Dynal Biotech）
0.5 ml、1.5 ml和 2 ml 微量离心管组织匀浆器（如 Polytron PT1200， Brinkmann Instruments）
16°C 水浴锅（可选）
带冷冻的热控制/循环仪
96 孔 PCR 板
干冰/甲醇浴
带固定转头或吊桶转头的台式离心机
平台型摇床
UV 盒和滤镜
Spin-X 离心过滤管（Costar）
0.1 mm 微电击杯
Bio-Rad 基因脉冲电转装置（或类似的装置）
15 ml 培养管
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