实验材料 植物
试剂、试剂盒 三氯乙酸β-巯基乙醇丙酮R2D2 蛋白质溶解缓冲液UKS 蛋白质溶解缓冲液IPG 胶条水化液
仪器、耗材 研钵和研槌
实验步骤
1. 蛋白质沉淀与变性
( 1 ) 用研钵和研槌在液氮中将植物材料研磨成细小的粉末（ 见注释 4) 。
( 2 ) 将约 200 μl 粉末转移到 2 ml 的离心管中，加入 1.8 ml 预冷的三氯乙酸-2ME-丙酮溶液（见注释 5) ，混和后置于 -20°C 1 h。三氯乙酸和丙酮可以使蛋白质变性并沉淀 ，同时还可以使各种多酚氧化酶和其他氧化酶类失活，从而阻止因酚类被氧化为醒类而导致的蛋白质互相结合形成难溶的复合体。该方法同酚抽提法[ 7,8] —样都能使蛋白酶失活[ 3] 。丙酮还可以溶解植物细胞内的各种色素、脂质以及萜类化合物。而 2ME 则可以阻止蛋白沉淀过程中二硫键的形成。
( 3 ) 10000 g 下冷冻离心机中离心 10 min。
2. 2ME-丙酮溶液清洗蛋白质样品
( 1 ) 弃掉离心所得上清后用 1.8 ml 预冷的清洗液（见注释 5 ) 悬浮沉淀。-20°C 静置 1 h。清洗目的在于去除残存的三氯乙酸，避免因为酸化作用而导致的蛋白质难以复性溶解。
( 2 ) 10000 g 下冷冻离心机中离心 15 min。
( 3 ) 弃掉上清液，重复清洗操作 2 次（见注释 6)。
( 4 ) 将沉淀进行真空干燥 1 h ( 或 SpeedVac 中干燥 20~30 min) 以完全去除残留的丙酮。
( 5 ) 称量沉淀重量 （见注释 7)。
3. 蛋白质的溶解
( 1 ) 溶解蛋白质样品所需 UKS 或 R2D2 的量根据不同植物组织而定。例如，对于玉米和葡萄叶片的蛋白质样品我们按 60 μl/mg 干粉的比例进行溶解，而对玉米粒的蛋白样品则按 50 μl/mg 干粉的比例进行溶解。
( 2 ) 振荡 1 min 即可重新溶解干粉样品。此时，样品中含有细胞碎片。
( 3 ) 10000 g 室温下离心 15 min，收集上清于另一离心管中。
( 4 ) 再次离心 15 min，上清液即为所得蛋白质样品，可以在 -50 或 -80°C 保存数月。
一般而言，用于悬浮和溶解蛋白质样品的溶液中都含有离合剂、变性剂以及还原剂 [9] 。离合剂可以打断蛋白质内部的非共价键，从而帮助蛋白质去折叠。最普遍使用的离合剂是尿素和硫脲。常常将两者结合使用以提高对蛋白质的溶解效率。而在使用离合剂的同时，必须使用变性剂才能增加对蛋白质的溶解。CHAPS 是一种兼性离子变性剂 ，它和非离子变性剂 Triton X-100 具有相同的助溶能力，但是它能更有效地阻止蛋白质之间的相互作用。SB3-10 比 CHAPS 具有更强的助溶能力，但是它在尿素浓度较高的溶液中难以溶解。巯基还原剂（最常见的如 DTT ) 和氢化磷可以阻止二硫键的形成 。磷化氢比 DTT 具有更强的选择性和更高的效率，它在酸性条件和 pH 大于 7.5 的环境下仍能保持还原能力。常常以 TCEP- HCl (triscarboxyethyl phosphine) 的形式保存 ，相比 TBP 的保存形式，该形式更稳定、难挥发、更容易溶于水。
在 R2D2 蛋白质溶解液适用于用 IPG 胶条进行等电聚焦，该溶液的配制结合使用尿素与硫脲（见注释 2)、CHAPS 与 SB 3-10、DTT 与磷化氢。
UKS 溶液是早期在发现硫脲与兼性离子变性剂可以大大增加蛋白质的溶解前常常使用的一种蛋白质溶解液。该溶液含有较高浓度的尿素 （接近饱和，见注释 2 ) ，使用的是 Triton X-100 而不是 CHAPS 和 SB 3-10。UKS 的特点在于含有离子变性剂 SDS，可以大大提髙蛋白质的溶解效率，抑制蛋白酶的活性[ 10] 。尽管作为离子变性剂 SDS 与等电聚焦缓冲系统不兼容，但是因为 Triton X-100 的存在能和 SDS 形成胶态离子，在电泳过程中移到阴极，故缓冲系统能够容忍该浓度 SDS 的存在。UKS 也含有 K2CO3 可以使得缓冲系统碱性化，从而组织蛋白质与蛋白质以及蛋白质与核酸之间的互作，抑制蛋白酶活性。
R2D2 既可以用来溶解蛋白质样品，也可以用来水化 IPG 胶条；而当使用 UKS 溶解的蛋白质样品时，则必须使用另外一种 IPG 胶条水化液。两种溶解液的蛋白质溶解能力大致相当，因此，建议只使用其中一种。如果制备的样品中可能会有较多的蛋白酶时，推荐使用 UKS。向两种溶液中加入两性电解质可以提高等电聚焦电泳的分辨能力。
4. IEF 电泳前蛋白质样品的准备
( 1 ) 蛋白质样品在电泳前需要再次离心，去除沉淀。
( 2 ) 若采用硝酸银染色法，每根胶条（24cm 长，自制胶或 IPG 胶条）的上样量约为 50 μg 蛋白质（图 1-1A 、B ) ; 若采用 CBB 染色法，则为 150~500 μg （图 1-1C 、D) 。
( 3 ) 溶解在 R2D2 中的蛋白质样品可以在用 R2D2 溶液补足体积至 450 μl 后直接用来水化 IPG 胶条[ 6] 。
溶解在 UKS 中的样品可以直接用来进行传统的等电聚焦电泳[ 3] 。若采用 IPG 胶条进行等电聚焦，则必须用另外配制的水化液（ 图 1-1A 、B，见注释 8 ) 补足体积至 450 μl 后进行水化。单独配制的水化液含有硫脲、CHAPS 及三氢化磷，同时还可以降低 SDS 的浓度，提高分辨率。
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