细胞P38α激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
YIJI细胞P38α激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在P38α激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到P38α磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中P38α活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中P38α激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
P38促分裂素原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinases；P38MAPK；EC2.7.11.24），又称为细胞分裂素特异性结合蛋白（Cytokinin Specific Binding Protein；CSBP），属于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一类中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK（细胞外信号相关激酶；extracellular signal related kinase）、P38、Big MAPK1等的一员。酵母的同源基因为Hog1p。在哺乳动物细胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，P38信号通路是其中之一。P38MAPK属于丝氨酸//苏氨酸（serine/threonine）蛋白激酶家属。和ERK和JNK通路一起，将细胞外信号转化为特定细胞反应。P38通路受到各种促炎性刺激（proinflammatory stimuli）例如生长因子、激素、GPCR配体、促炎性细胞因子白介素1和8、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等，以及细胞应激（UV、渗透压休克osmotic shock、内毒素、热休克、化学毒素等）而活化，通过MAPK激酶3和6（MKK3和6）、Jun N-terminal kinase kinase1，以及与MAP3k7IP1/TAB1反应，获得磷酸化后，由胞浆转移到胞核，进而激活下游MK2、MK3、PARK、Mac、MSK、MNK1、转录因子（STAT1、NFAT、ATF2、MEF2C、P53、CHOP、MAX、CDC25B）、MnSOD等，达到调节促炎性细胞因子的转译、各种细胞外刺激的基因表达、细胞周期、分化、凋亡的调节、TNFα、IL1、COX2的生物合成等功能。P38通路异常，将导致风湿性关节炎、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、银屑病（psoriasis）和癌症等，由此P38成为药物靶标。P38 MAPK蛋白激酶有5个亚酶，包括α（MAPK14/SAPK2A）、β（MAPK11）、γ（MAPK12/ERK6/SAPK3）、δ（MAPK13/SAPK4）、P38-2。其中P38α为广谱表达，由MAP激酶激酶（MKK）激活以及MAP3K7IP/TAB1蛋白反应后激活，其作用底物为ATF2、MEF2C、MAX、CDC2B、P53等，与细胞繁殖、分化、细胞周期、转录调节、炎性反应、细胞因子合成、发育（红细胞、胎盘）等有关；P38β为广谱表达，主要由MAP激酶激酶6（MKK6）激活，其作用底物为ATF2/CREB2；P38γ主要在骨骼肌组织表达，是成肌细胞（myoblast）分化为肌管（myotube）的信号传导者；P38δ在肺、胰腺、肾、小肠、睾丸等组织高表达，主要由MAP激酶激酶3和6（MKK3和6）激活，其作用底物为ATF2、Tau、Stathmin、eEF2K等，与角质形成细胞（keratinocyte）分化有关。P38α磷酸化目标序列为IPTTPITTTYFFFKKK。基于底物IPTTPITTTYFFFKKK，在P38α敏感性抑制剂SD169的存在与否的情况下，受到P38a激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析P38a激酶的活性。其反应方式为：
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI缓冲液（Reagent C） 毫升
YIJI酶促液（Reagent D） 微升
YIJI反应液（Reagent E） 微升
YIJI底物液（Reagent F） 微升
YIJI阴性液（Reagent G） 微升
YIJI专性液（Reagent H） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
P38α激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品预处理
比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
待测样品准备
准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖生长表面
小心抽去清理液
使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
小心抽去上清液
加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混匀
转移到预冷的1.5毫升离心管
强力涡旋震荡15秒
置于冰槽里孵育30分钟
放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
测定准备
准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
背景对照测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
样品总活性测定
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
样品非特异活性测定
检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
放进30℃培养箱里静置3分钟
加入20微升上述预处理的待测样品
上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
计算样品活性
样品总活性和非特异活性计算
2）样品特异活性计算
七、酶标仪测定
样品总活性测定
在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
轻轻摇动96孔板
在30℃温度下孵育3分钟
分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
轻轻摇动96孔板
即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
活性计算：
样品非特异活性测定
检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
在96孔板上做好相应标记：待测样品
移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
轻轻摇动96孔板
在30℃温度下孵育3分钟
加入20微升上述预处理的待测样品
轻轻摇动96孔板
即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
活性计算：
样品特异活性计算
八、抑制剂筛选
在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
按下表加入试剂，进行样品预处理
内容物
空背景对照
样本背景
完全酶活性
待测抑制剂酶活性
YIJI缓冲液（Reagent C）
xx微升
xx微升
xx微升
xx微升
YIJI阴性液（Reagent G）
xx微升
xx微升
xx微升
——
待测抑制剂
——
xx微升
――
xx微升
用户自备的纯化酶
——
——
xx微升（1毫单位）
xx微升（1毫单位）
96孔板每孔总量
空背景对照孔
（xx微升）
样本背景孔
（xx微升）
完全活性孔
（xx微升）
待测抑制剂样品孔
（xx微升）
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作
分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
轻轻摇动96孔板
在30℃温度下孵育3分钟
加入20微升上述预处理的待测样品
即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
抑制活性计算：
注意事项
本产品为20次操作
操作时，须戴手套
系统操作过程中，背景测定只需1次
样品处理忌用磷酸缓冲溶液
样品须澄清，至关重要
如果出现明显的干扰现象，建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
光度测定后，比色皿须清洗彻底
样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
可以使用P38α抑制剂（VX745；IC50=10纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
P38α激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.6条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定检测敏感
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