1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。原因： 一抗和二抗不匹配。
2.参照说明书，设置阳性对照。原因：一抗不识别检测物种蛋白。
3.每泳道蛋白上样量不低于20~30μg，设置阳性对照。原因：抗原量不足。
4.使用可逆染色剂如丽春红S检测转膜效果，检测转膜操作是否正确。PVDF膜预先浸在甲醇中。原因：转膜不充分。
5. 使用含0.5%脱脂奶粉或更换封闭剂，减少封闭时间。原因：过度封闭使目标蛋白不能显色。
更好的解决多条带现象的5点建议：
1.查阅文献。原因：体内表达的蛋白具有多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，糖基化等。
2.在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。原因：蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）。
3.降低抗体浓度或者抗体孵育时间。原因：一抗浓度过高，高浓度时常出现多蛋白条带。
4.使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照试验。原因： 细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同。
5.降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）。原因：二抗浓度过高，高浓度产生非特异结合
更好的解决背景高的5点建议：
1.稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间。
2.抗体孵育温度过高： 4℃孵育。
3.膜干燥：保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
4.封闭不充分： 延长封闭时间， 考虑更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）。
5.未结合蛋白洗涤不充分： 增加洗涤次数。
更好的解决其它问题的5点建议：
1.转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑点：抗体结合了封闭剂（过滤封闭剂）。
3.“微笑”条带：迁移过快或电泳温度过高，改变了pH值和迁移速度（降低迁移速度或低温电泳）。
4.抗体量不足：确保在孵育时抗体充分浸没膜。
5.目的条带染色过低/过高：分离不彻底。
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