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Western印迹法(试剂配制和操作步骤)-2

2020.9.01
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

(二)使用液

单去污剂裂解液(50mmol/L Tris•HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,100?g/ml PMSF):
1mol/L Tris•HCl(pH8.0) 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后, 4℃保存。使用时,加入PMSF至终浓度为100?g/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。

0.01mol/L PBS( pH 7.2-7.4)
0.2 mol/L NaH2PO4 19ml
0.2 mol/L Na2HPO4 81ml
NaCl 17g
蒸馏水至 2000ml

G250考马斯亮蓝溶液(测蛋白含量专用)
考马斯亮蓝G250: 100mg
95%乙醇: 50ml
磷酸: 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4℃保存。

0.15 mol/L NaCl
NaCl(MW58.44) 0.877g
蒸馏水至 100 ml
高温灭菌后,室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)
BSA 0.1g
0.15 mol/L NaCl 1ml
溶解后,-20℃保存。制作蛋白标准曲线时,用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml,-20℃保存。

10%分离胶和4%浓缩校
10%分离胶(两块胶,10ml) 4%浓缩胶(两块胶,5ml)
超纯水 4.85ml 3.16ml
40%Acr/Bic(37.5:1) 2.5ml 0.5ml
1.5 mol/L Tris•HCl(pH8.8) 2.5ml -
0.5 mol/L Tris•HCl(pH6.8) - 1.26ml
10%SDS 100 ml 50 ml
10%AP(过硫酸胺) 50 ml 25 ml
TEMED 5 ml 5 ml
加 TEMED后,立即混匀即可灌胶。

还原型5XSDS上样缓冲液(0.25mol/L Tris?HCl pH6.8,0.5mol/L二硫叔糖醇,10% SDS,0.5%溴酚蓝,50%甘油)
0.5 mol/L Tris•HCl(pH6.8) 2.5ml
二硫叔糖醇(DTT,MW154.5) 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml

混匀后,分装于1.5ml离心管中,4℃保存。

电泳液缓冲液(25mmol/L Tris,0.25mol/L甘氨酸,0.1% SDS)
Tris(MW121.14) 3.03g
甘氨酸(MW75.07) 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,次溶液可重复使用3~5 次。

转移缓冲液(48mmol/L Tris,39mmol/L甘氨酸,0.037% SDS,20%甲醇)
甘氨酸(MW75.07) 2.9g
Tris(MW121.14) 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,次溶液可重复使用3~5次。

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