3. 第一链产量测定
第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%
掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)
设330为每mol dNTP的平均分子量
合成cDNA量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA量(ng)×100%
例如总放射性活性强度为254，000cpm， 掺入放射性活性强度为3040cpm， 所用RNA摸板量为1μg，反应体积为25μl， 则:
掺入率＝3040/254000×100%=1.2
掺入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定，而反应体积占总体积80%，因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。
4. 第二链产量计算
除需去除第一链掺入dNTP外，方法同第一链产量计算
第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??
掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率
第二链cDNA合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/ 单链cDNA合成量(ng)
例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp， 总放射性活性强度为235000cpm.
第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%
第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
双链cDNA转变率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。
（四） 电泳分析
通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基，需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提，乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12步，一般第一链和第二链上样量相同。
1. 标准分子量DNA参照物的同位素标记
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段，用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记
10×HindⅢ缓冲液 2.5μl
dATP 0.2mmol/L
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg
Klenow DNA聚合酶 1μ
加H2O 到总体积25μl
(2) 室温放置10分钟， 加2.5μl 200mM EDTA终止反应， 加入2×样品缓冲液，贮存于-20℃。
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