PCR扩增产物的电泳分析-2

2）染色剂：核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。
银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。
4、电泳
1）电泳装置：电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等。
2）电泳方法
①用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。
②根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳。
③配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化。冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固。

④向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。
⑤在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。
⑥接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)。电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。
⑦根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物50V电压， 电泳20～40min即可。
3）溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差 0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表2.。

*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp)。

1、材料
1）电泳仪器：电泳仪，垂直电泳槽及其附件。
2）30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 装于棕色瓶内，4℃可保存二个月。
3）10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克 加水至，10ml 4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
4）1XTBE电泳缓冲液
5）TEMED(四甲基乙烯基二胺)
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳
根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶。
1）按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2）将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。
3）按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
4）加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。
5）立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会。
6）室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液。
7）小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则。
8）将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡。
9）接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳。
10）根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。
11）电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上。浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果。
12）聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带。要求更高的灵敏度，可用银染。