7.探针的制备
1.在1.5ml离心管中配制以下反应液：
模板DNA(25 ng) 1ul
Random Primer 2ul
灭菌水 11ul
总体积：14ul
2.95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。
3.在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4.混匀后（25ul），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。
5.65°C加热5min使酶失活。
8.探针的纯化及比活性测定：
1.准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE（PH7.6）。
2.取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填 Sephadex G-50凝胶。
3.将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加 Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处
4.100ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。
5.倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了 Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。
6.将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5ul点样于DE8 paper上，其余上样于层析柱上。
7.1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.
8.测比活性(试剂比活要求:106cpm/ml）。
9.预杂交：
1.将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。
2.加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2 膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。
10.探针变性：
1.用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
2.90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。
3.短暂离心，将溶液收集到管底。
11.杂交：
1.加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。
2.42℃杂交过夜（14~24hr）。
杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。
12.洗膜：
1.低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。
2.高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20min两次。
13.曝光：
1.将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。
2.检查膜上放射性强度，估计曝光时间
3.将X光底片覆盖与膜上，曝光
4.冲洗X光底片，扫描记录结果。
14.去除膜上的探针：将200ml 0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让 SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。
15.杂交结果
操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡
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