免疫沉淀实验原理、仪器试剂和操作步骤

（一）原理

免疫沉淀是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗体－目的蛋白复合物，沉淀经洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5－10 min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

（二）试剂

1．PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800 ml双蒸水中，用HCl调PH至7.4，在补加水至1L，高压灭菌后保存于室温。

2．NaCl：5.8 g NaCl溶于 80 ml双蒸水中，再补加水至100 ml，高压灭菌。

3.1 1M Tris（pH 7.5）: 12.1g Tris碱，溶于80 ml双蒸水，用 HCl调 pH至7.5，再补加水至100 ml。

4．蛋白酶抑制剂：Aprotinin和Leupeptin溶于双蒸水，PMSF溶于异丙醇，浓度均为10 mg/ml。

5．N-40：10％（w／V）。

6．脱氧胆酸钠：10％（w／v），溶于10 mM HEPES（pH 8.0）。

7．细胞裂解液：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin、1ug/ml Leupeptin、l％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠。

8．稀释液：50 mM Tris（PH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg／ml PMSF、1 ug／ml Aprotinin，1 ug/mlLeupeptin、0.1％NP-40。

9．洗涤液 Ⅰ：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1％NP-40。

10．洗涤液Ⅱ：10mMTris（pH 7.5）。

11．ProteinA／G－Agarose。

12．2×SDS－PAGE电泳上样缓冲液：100 mMTris（pH 6.8）、200 mM DTT、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油。

（三）操作步骤

1．离心收集细胞，PBS洗涤2次。细胞用量根据目的蛋白表达的水平而定，一般用 1×107－5×107 细胞。

2．按 1×107 细/ml加人细胞裂解液，于冰浴上超声破碎，然后再冰浴 30 min。

3．4℃ 12 000 ×g离心 10 mn，取上清。

4．往上清中加人50 ul的蛋白 A／G－agarose，于4℃在摇床上温和摇1－3 h进行预清除。

5．12 000转离心20 s，取上清。

6．将上清等分成两份，补加稀释液至1ml，其中一份加人1－10 ug识别目的蛋白的抗体，另一份加人等量的对照抗体，于4℃在摇床上温和摇2 h，然后加入50 ul的蛋白A／G－Agarose于4℃在摇床上温和摇过夜。

7．离心弃上清，用洗涤液Ⅰ洗沉淀4次，洗涤液Ⅱ洗 2次，每次洗涤于4℃在摇床上温和摇20 min。

8．离心弃上清，用4号针头尽可能移去液体。

9．加人20－50 ul的电泳上样缓冲液，于100℃煮5－10 min，离心收集上清。上清中含有目的蛋白和抗体，可进一步用蛋白电泳和Western blot进行定性和定量。
四）注意事项

1．不同种属来源及不同亚类的抗体与蛋白A和蛋白G的－结合力不同（表），有的甚至不能结合，如小鼠的 IgM，这类抗体不能用蛋白 A／G－agarose直接免疫沉淀。

2．PMSF对身体有害，注意防护。

3．根据免疫沉淀的结果，洗涤液Ⅰ的盐离子浓度可作一定的调整，如果沉淀的杂蛋白较多可适当增加盐浓度，如果抗体与目的蛋白的结合力较弱则适当减低盐浓度。

不同种属和不同亚类抗体与Protein A、Protein G的结合力

w：Weak binding，S：Strong binding，w／s：Indifferent，

nb：No binding，—：Information not available