3.平衡 将DEAE―纤维素放入0.0lMol/L pH 7.4 PB液中(即起始缓冲液),静止1h,不时搅拌,待纤维素下沉后,倾去上清液或抽滤除去洗液,如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4.装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言,柱长和柱直径之比为10:1~20:1,柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h,然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
装柱时,先剪一块圆形的尼龙纱布(直径与层析柱内径一致),放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管,夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上,倒入起始缓冲液至一半的柱高,除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE-纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡,如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹,使流速至1ml/5min,待缓冲液快接近纤维素面时,继续倒入纤维素糊,同时用玻璃棒搅拌表面层,以免使两次加入的纤维素形成分界层,通过进出缓冲液调节流量,也可通过塑料管的升降来控制,至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸(与柱内径大小一致),从柱的上端轻轻放入,使其沉接于纤维素床表面,以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的,无倾斜,整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡,使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。
5.上样
要层析的样品首先必须用起始缓冲液(4℃)平衡过夜,中间可换液数次。将柱的上端打开,用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出,不要吸净,留一薄层液面,以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品,注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹,使样品进入交换剂中,快要进完时,加1ml~2ml缓冲液冲洗柱壁,随即用多量的洗脱液洗脱。
样品的加量与DEAE―纤维素有一个最适比的关系,超过这个比值,吸附就不完全,直接影响到分离的纯度。经过粗提的 ―球蛋白50mg~100mg,用干重约4g DEAE-纤维素装柱分离,可获得理想结果。
6.洗脱 对于阴离子交换剂而言,洗脱的办法是使pH逐渐降低,而离子浓度逐渐升高。一般的办法,是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法,前者较实用,后者较准确。
表1-5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系
成 分 |
等电点 |
DEAE吸附能力 |
解吸顺序 |
白蛋白
|
4.9 5.6 5.1 7.3 |
强
弱 |
后
先 |
表1-6 血清的分段洗脱成分
NaCl浓度(Mol/L) |
0.01Mol/L PB(pH) |
洗脱部分 |
0.025 |
8.0 |
IgG |
0.030 |
7.0 |
IgG |
0.040 |
7.0 |
运铁蛋白、纤维蛋白原 |
0.060 |
6.5 |
白蛋白、IgA |
0.150 |
6.5 |
IgM 白蛋白 |
表1-7 各种Ig解脱吸附条件
不加NaCl PB离子强度(Mol/L) |
pH |
Ig |
其他 |
0.01 |
8.0 |
IgG |
|
0.025 |
8.0 |
IgE |
|
0.035 |
7.0 |
IgA |
|
0.040 |
5.9 |
球蛋白 |
|
0.10 |
5.8 |
白蛋白 |
|
0.40 |
5.2~4.5 |
IgM |
球蛋白 |
7.洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集,并以20%磺基水杨酸测试,当蛋白液下来时,开始分管收集,至无蛋白液为止。
8.交换柱的再生 将使用过的DEAE-纤维素移入 烧杯中,用2Mol/L NaCl液浸泡,抽滤并洗涤数次。如不立即使用,可加1/10 000的叠氮钠防腐,保存于4℃冰箱中。使用时,再以碱-酸-碱处理。