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蛋白质沉淀(Protein Precipitation)浓缩方法原理及详细解析-1

2020.9.07
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王辉

致力于为分析测试行业奉献终身

在生化制备中,沉淀主要用于浓缩目的,或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂:
1.盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
2.有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化,有时也用于蛋白质沉淀。
3.等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少,多与其它方法结合使用。
4.非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。
5.生成盐复合物沉淀用于多种化合物,特别是小分子物质的沉淀。
6.热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。
第一节盐析法
一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离,如蛋白质、多肽、多糖、核酸等,其中以蛋白质沉淀最为常见,特别是在粗提阶段。
盐析法分为两类,第一类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液;第二种叫Kb分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶。
一.影响盐析的若干因素
1.蛋白质浓度
高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量,但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近,若蛋白浓度过高,会发生严重的共沉淀作用;在低浓度蛋白质溶液中盐析,所用的盐量较多,而共沉淀作用比较少,因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时,宁可选择稀一些的蛋白质溶液,多加一点中性盐,使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。
2.离子强度和类型
一般说来,离子强度越大,蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候,一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后,经过过滤或冷冻离心收集,再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度,使另一种蛋白质组分盐析出来。
离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响,离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强,离子半径大而低电荷的离子的影响较弱,下面为几种盐的盐析能力的排列次序:磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
3.PH值
一般来说,蛋白质所带净电荷越多溶解度越大,净电荷越少溶解度越小,在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率,多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的,需根据实际情况调整溶液PH值,以达到最好的盐析效果。
4.温度
在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。

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