3.2 Differential display PCR(DD-PCR) DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT-PCR方法,主要用于 2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列,根据poly+ (A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为12类(见图3)。根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种 cDNA分别做模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于 2种种源近似生物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
3.3 Representative difference analysis PCR (RDA-PCR)［3～5］ 这是一种差减杂交 (subtractive hybridizatio-n)与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带,其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基因掩盖起来,而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。其操作程序为:(1)用同一限制性内切酶(一般用Bam HI,Bgl II或Hind III)同时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基因组DNA的量；(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头,其序列与酶切产生的粘性末端的序列相对应；(3)将2个基因组的DNA混合后,高温变性,低温退火。由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA 量,那么与掩盖基因组DNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因的影响；(4)用Taq DNA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应的引物,经过30个左右的PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。这种方法的起始操作程序较复杂,各反应步骤要求准确无误,但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。
4 用特异抗体克隆基因
用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有:(1)制备识别功能抗原的单克隆抗体;(2)将SDS-
PAGE分离的蛋白质特异带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质;(3)用Western-blot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA文库,从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。
5 特异基因的功能克隆
它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。基因的功能克隆主要有2种:一是phage display［6，7］,另一是peptide display。后者的原理与前者基本相同。目前以phage display的应用最为广泛,本文只对这一方法加以介绍。
任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程中,病原体本身的蛋白质成分(ligand)需要首先与宿主细胞上的受体 (receptor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上的Heparan sulfate受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用成分的特性与功能分析,是制订免疫预防措施及制备阻断药物的前提。phage display法是克隆病原体ligand的一种最为理想的手段。
Phage display的基本操作过程为:(1)提取某一病原体基因组DNA, 用超声波将DNA切割成500～1 500的片段;(2)将片段末端用T4DNA聚合酶处理后,与载体DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅助噬菌体(helper phage)同时转染大肠杆菌。phagemid在大肠杆菌内包装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入的外源基因片段表达,表达产物主要集中在噬菌体颗粒的表面；(3)将特定的受体固定于载体上(多为ELISA板),方法同一般的ELISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后,加入平板孔内,感作一段时间,用 PBS等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合,那些表达非相关蛋白的噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱; (4)用高强度NaCl液将结合在受体上的噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌,便可将编码特异功能蛋白质的基因克隆。
一个真核生物至少含有10万个不同的基因,其中只有10%～15%的基因在不同的发育时期表达,且不同的基因表达的强度相差甚远。在致病生物中,致病力强的生物,其致病因子(往往是1种或几种功能蛋白或酶)的表达量往往多于致病力弱的生物。从基因组中将人们感兴趣的基因或其转录产物扩增并克隆出来,是进一步对所编码蛋白质作功能分析的关键。本文介绍的几种基因克隆的方法是近几年应用比较广泛的方法。在具体实验中选择哪一种方法,还要根据研究者所要克隆的基因及其所在的基因组和对该基因的研究背景来决定。
作者单位:解放军农牧大学动物医学系, 长春 130062
第 1作者： 陈启军， 男， 1963年生， 博士。
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